控制近视的新靶点-巩膜缺氧

近视是世界上导致视力下降最主要的原因。随着过去20年近视发病率的不断增高，目前它已成为一个主要的公共健康问题。在2000年，有14.06亿人是近视眼（占世界人口的22.9%），其中高度近视的有1.63亿人（占世界人口的2.7%）。预计到2050年，近视人群将达到世界人口的49.8%，高度近视将达到9.8%。尽管近视可以通过框架眼镜等进行屈光矫正，但是它会明显增加其他致盲性眼病的风险，比如近视性黄斑病变，视网膜脱离，青光眼，白内障等。虽然增加户外活动时间，使用OK镜以及局部阿托品等方法对于近视进展有延缓作用，但是由于他们的作用机制以及近视的发病机制不明，因此效果有限。因此迫切需要一个能更好解释近视发病的理论，且能发展安全有效的治疗措施。

近视的发展与眼轴的过度增长有关，在近视的动物模型和人类中，这种改变常常伴随着巩膜的变薄，而巩膜正是能维持眼球形状和完整的重要组织。在不同近视模型中的巩膜改变，促进了巩膜在近视发展中潜在机制的研究。这些研究已经表明近视相关的巩膜细胞外基质（ECM）的重塑与ECM成分的合成减慢和分解加速有关。因此破坏了巩膜结构的完整性，导致眼轴的增长。可如何引起这些改变的机制仍旧不明，其中的关键性问题是近视相关的巩膜ECM重塑是如何被诱发的。一种假设是视网膜的视觉信号产生一种我们未知的分子，并在脉络膜中启动反应。紧接着脉络膜产生信号并传递到巩膜并诱导ECM的重塑。

哺乳动物的巩膜是由单一的纤维层组织组成，包含有各类异质的细胞群，如成纤维细胞和肌成纤维细胞，以及巨噬细胞和树突状细胞。但是既往由于实验的难度，很难将这些不同的巩膜细胞分离开并对他们进行特异性的分析。因此到目前为止，研究者都是将巩膜组织进行整体研究。但是这种方法就限制了研究者在巩膜诱导近视发展中发现局部和细胞特异性的信号分子的改变。而单细胞RNA测序技术的出现能很好的解决视网膜中存在不同细胞类型的复杂问题。因此在本研究中，研究者就利用了单细胞RNA测序的技术，来检测巩膜组织中不同细胞类型的基因表达情况，是如何导致细胞的表型改变的（成纤维细胞到肌成纤维细胞），以及在近视发展中巩膜的ECM的变化。研究结果发表在PNAS杂志上。

首先从行觉剥夺（近视模型）和对侧眼正常的小鼠眼球的巩膜中分离出93个单细胞，并对他们进行转录组的分析，在剔除掉22个的细胞后，剩余的71个细胞均表达成纤维细胞的标记基因（Vim,Col1a1,Col1a2,S100a4,Acta2,Postn,Fap,Ddr2）（图1A）。通过计算71个巩膜成纤维细胞每个基因表达水平的平方变异系数（CV2），我们确定了4463个基因在表达上具有异质性（图1B）。将这些基因进行层次聚类分析（图1C），可以将这71个细胞分类成2种主要的类型，可以称为A1和A2，分别包含20个和51个细胞。虽然A1和A2两种纤维细胞类型均存在于行觉剥夺和正常的眼中，但是A2细胞的比例在行觉剥夺的眼中明显高于正常眼（图1D）。通过成纤维细胞和肌成纤维细胞标记基因表达的高低，可以定义A1细胞为静止的成纤维细胞（成纤维样细胞），A2细胞为肌成纤维细胞或者是由成纤维细胞分化为肌成纤维细胞过程中的中间状态的细胞（肌成纤维样细胞）。从成纤维样细胞到肌成纤维样细胞转化的过程中发现有660个基因具有明显的改变（P<0.05,TPM>2或者<0.5）。通路分析发现差异表达的基因明显聚集于26条通路中，且其中有9条通路显示出显著的预测活性模式（图2A）。最顶端的富集通路分别是eIF2信号，mTOR信号和心血管系统中的缺氧信号通路，这些信号通路均对缺氧起调节反应，这些改变提示这些缺氧相关的信号通路可能在行觉剥夺的眼中被激活。为了证明由单细胞RNA测序分析得到的相关信号通路的作用，研究者在行觉剥夺的小鼠上用RT-PCR来检测3条通路中8个差异表达基因的mRNA表达水平。与单细胞RNA测序的结果一致，这8个基因的mRNA表达在行觉剥夺小鼠的巩膜中明显升高，但是也发现在视网膜中的表达没有改变。这些结果均证明巩膜成纤维细胞中的eIF2，mTOR和缺氧信号通路均与近视的发展相关。

图1.A.确定细胞类型的标记物的表达B.红线代表基因的平均表达水平，粉红点代表差异基因的CV2低于观察值C.根据TPM将71个巩膜细胞进行层次聚类分析，X轴代表差异基因，Y轴代表巩膜细胞，其中粉色为行觉剥夺眼，蓝色为正常眼D.A1和A2细胞在正常眼和行觉剥夺眼中的比例，A2细胞在行觉剥夺眼和正常眼占的的比例分别为85.7%和58.3%（P=0.021）。

为了找到细胞分化过程中的关键分子，研究者又根据分层聚类的结果将肌成纤维样细胞分成4个亚组（图2B）。通过分析及相关性最后发现HIF-1α在成纤维细胞转化为肌成纤维细胞的过程中起关键作用（图2C）。然后利用蛋白质相互作用网络来研究近视相关的风险基因与信号通路的关系，发现HIF-1α分别与近1/3（45/145）的近视风险基因相关，10个（10/27）病理性近视相关的风险基因相关（图2D）。

图2.A.通路分析P<0.01且绝对激活分值>2的通路，除了PPAR/RXRα是被抑制，其余通路在A2细胞中均被激活B.A2亚群细胞的聚类分析C.不同细胞和亚组细胞的Hif1a表达D.人类病理性近视相关的风险基因与HIF-1α信号通路的关系

为了证明巩膜缺氧是近视的一个特征，在行觉剥夺2天和2周的小鼠，用Westernblot检测巩膜中HIF-1α的表达明显高于对照组，但是在视网膜中却没有差异。并且在行觉剥夺2周后，小鼠眼轴变长。为了进一步验证，在行觉剥夺和负透镜诱导2天和1周的豚鼠近视模型中，发现巩膜中HIF-1α的表达明显升高，而在去除诱导因素2天后，表达水平也恢复正常，而视网膜中的表达始终未发现变化。继续探索巩膜缺氧在近视中的作用，研究者在体外将人类巩膜成纤维细胞暴露在缺氧的环境下，发现HIF-1α蛋白及肌成纤维细胞的标记蛋白表达增加，成纤维细胞的标记蛋白表达减少，表明缺氧可能是通过巩膜肌成纤维细胞的分化来影响近视发展的。

而在行觉剥夺的豚鼠眼周注射抗缺氧的药物（红景天和芒柄花素）4周，发现HIF-1α的表达上调明显被抑制，COL1α1的表达下调也被抑制，而α-SMA的表达没有差别（图3A和B）。更为重要的是，连续4周注射红景天高剂量组（10ug/每天）比低剂量组（1ug/每天）控制近视进展的效果更好（图3C），眼轴的和玻璃体的长度也更短（图3D和E）。而连续4周注射芒柄花素高剂量组（5ug/每天）与低剂量组（0.5ug/每天）相比没有差别，但与空白组相比明显控制近视进展（图3F）,眼轴和玻璃体的长度两组也没有差别，但也都明显短于空白组（图3G和H）。相反，在正常的豚鼠中注射红景天和芒柄花素并不会引起屈光，眼轴和玻璃体长度的任何改变。同时研究者也发现在注射抗氧化药物后，行觉剥夺豚鼠的eIF2α和mTOR的磷酸化水平降低，而通过注射eIF2α和mTOR磷酸化抑制剂，可以控制行觉剥夺小鼠的近视进展，这些结果都证明了缺氧相关的信号通路在近视发展中的作用。

图3.A.在正常眼和行觉剥夺眼注射红景天，行觉剥夺眼HIF-1α的表达上调明显被抑制，COL1α1的表达下调被抑制，而α-SMA的表达没有差别;正常眼均没有差别B.在正常眼和行觉剥夺眼注射芒柄花素，行觉剥夺眼HIF-1α的表达上调明显被抑制，COL1α1的表达下调被抑制，而α-SMA的表达没有差别；正常眼均没有差别C.注射红景天高剂量组比低剂量组控制近视进展效果更好D,E.射红景天高剂量组比低剂量组眼轴和玻璃体长度更短F.注射芒柄花素高剂量组与低剂量组相比控制近视进展没有差别，但与空白组相比有明显差别G,H:注射芒柄花素高剂量组与低剂量组相比眼轴和玻璃体的长度没有差别，但也都明显短于空白组

综上研究结果，研究者提出近视相关的视觉信号可以造成脉络膜毛细血管和血流的降低，导致对周围无血管巩膜的氧气和营养成分供给减少，巩膜缺氧由此出现，随之HIF-1α的表达上调，eIF2α和mTOR的磷酸化水平增高，并促进肌成纤维细胞的转化和胶原蛋白的减少，这些导致巩膜ECM的重塑，使得巩膜变得薄弱，最终导致眼轴增长和近视的发展（图4）。当然还需要更多的实验来证明脉络膜与巩膜间相互作用的详细机制。

该项研究不仅为我们提供了一个理解近视发病机制的概念，也为我们提出了可以控制近视进展的可行方法。

参考文献：WuH,ChenW,ZhaoF,etal.Scleralhypoxiaisatargetformyopiacontrol.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica.2018;115:E7091-E7100

短评：

毋庸置疑，近视已经成为一个全球性公共健康问题，不仅因为其发病率增长，程度加重以及发病年龄提前的显著性趋势，更因为就目前而言，在多种高发疾病逐渐被关注、被成功防治的先进医疗环境下，针对近视的预防和治疗在大部分时候仍是汲深绠短，而造成这一现状的主要原因则是对近视发病机制的不清楚，不理解，和不深入。本研究从巩膜缺氧作为着眼点，成功指出巩膜缺氧对近视的促发作用，因此进一步解释了近视发生时ECM的薄弱和病态重塑，使抑制和治疗巩膜缺氧有望成为近视防控的重要突破点，具有深远的基础和临床意义。