哺乳动物视细胞再生的新来源

在斑马鱼中，Müller细胞是一种视网膜干细胞，可以稳定持续的增殖并补充损伤的视网膜神经细胞，自我修复机制十分完善。但在哺乳动物中，Müller细胞缺乏再生能力，无法自发地进入细胞周期。虽然视网膜损伤可以刺激Müller细胞增殖，但是再生的神经细胞数量有限，还不足以代偿视网膜损伤导致的细胞死亡。而且还没有足够的证据表明Müller细胞起源再生的细胞能提高哺乳动物的视功能。本研究通过对Müller细胞的重新编程，检测在无视网膜损伤的情况下，Müller细胞是否能再生成视杆细胞，并提高视功能，研究结果发表在2018年的Nature杂志上。

为了研究在成熟的视网膜中Müller细胞能否再生为视杆细胞，研究者使用了2步重编程的方法。首先在4周的小鼠玻璃体腔内注射GFAP-β连环蛋白，刺激正常小鼠的Müller细胞分裂，2周后再在玻璃体腔内注射Otx2、Crx和Nrl来促使分裂的细胞发育成视杆细胞，并分别在1、2、4周后分析视杆细胞的分化情况。结果发现注射4周后，处于视杆细胞终末阶段的已占97.4%，且每个象限的细胞密度大于800个/mm2。但是研究者也发现，如果在7月大的小鼠视网膜中进行重编程，分化成视杆细胞的比例则明显减少，每个象限的细胞密度仅为200个细胞/mm2。（图1）

图1.a.小鼠视网膜Müller细胞重编程2步的过程b-j.Müller细胞分化为视杆细胞的3个阶段的细胞形态，初期（b-d），中期（e-g），末期（h-j）。三角箭头细胞-体部；箭头-视杆细胞外节；双箭头-细胞突触。k-m.重编程1周（k）、2周（l）、4周（m）后不同阶段视杆细胞所占的比例。n-o.未编程（n）和编程（o）的小鼠视网膜。三角箭头-视杆细胞体部；箭头-视杆细胞外节。p-t.视网膜4个象限，背侧（p）、鼻侧（q）、颞侧（r）、腹侧（s）分化的视杆细胞的分布及数量对比（t）。

接着研究者利用共聚焦显微镜和免疫荧光证明了这些Müller细胞起源分化的视杆细胞确实表达视杆细胞的相关蛋白，并利用透射电子显微镜观察到这些细胞具有相应的视杆细胞结构，包括外节、内节、连接纤毛以及突触。（图2）

图2.a-t.Müller细胞起源分化的视杆细胞（红色）上表达各种视杆细胞的相关蛋白（绿色）。包括rhodopsin(a–d),peripherin-2(e–h),GNAT1(i–l),recoverin(m–p),andribeye(q–t)。三角箭头表示在视杆细胞里发现免疫反应。u-x.Müller细胞起源分化的视杆细胞（红色）在靠近双极细胞处（绿色）有扩大的突触（三角箭头）。y-ac.电镜下分化的视杆细胞的各个结构。包括含有膜盘的视杆细胞外节（y），含有线粒体的视杆细胞内节（z），含有微小管（箭头）的纤毛（aa，ab）和含有水平细胞轴索终末端（H，绿色阴影）以及双极细胞树枝状终末端（B，褐色阴影）的典型突触（ac）。

为了证明这些分化的视杆细胞具有相应的功能，研究者又在Gnat1rd17Gnat2cpfl3双敲的小鼠模型上对Müller细胞进行重编程，看是否能恢复小鼠模型视杆细胞的功能，在重编程分化的4周后，我们观察到小鼠模型的视网膜中出现了视杆细胞的各个结构且恢复了视杆细胞的转运功能。（图3）

图3.在Gnat1rd17Gnat2cpfl3双敲的小鼠模型上再生的Müller细胞起源分化的视杆细胞。a-f．GNAT1（绿色)，Müller细胞起源分化的视杆细胞（红色）。在光线的刺激下，通过视杆细胞的作用，GNAT1从视杆细胞外节（a-c）移动到视杆细胞内节、视杆体部和突触终末端（d-f）。g-k.在小鼠模型视网膜的4个象限-背侧（g）、鼻侧（h）、颞侧（i）和腹侧（j）出现了大量Müller细胞起源分化的视杆细胞（红色），k图代表具体数量。

最后，研究者对视网膜进行了各种功能学检测，发现分化的视杆细胞能产生电反应并传导信号。(图4)

图4.小鼠模型视网膜上分化的视杆细胞能够整合入视网膜循环并产生电反应信号。a.Müller细胞起源分化的视杆细胞显示有钙离子信号。b-d.治疗组神经节细胞对绿光有on-off反应。e.治疗组相比对照组对绿光的反应振幅更高。f-g.对不同刺激光的不同光强，治疗组比对照组峰值更高。h.治疗组和野生型组神经节细胞on反应刺激后峰值的比较。i.野生型组的神经节细胞的on反应峰值明显大于治疗组。j.治疗组和野生型组off反应刺激后峰值的比较。k.野生型组的神经节细胞的off反应峰值大于治疗组。l.1只对照、治疗、野生型小鼠的VEP反应。m.2只对照、2只治疗、3只野生型小鼠VEP的峰值比较。

通过以上实验，研究者证明了Müller细胞在没有视网膜损伤的情况下也可以在哺乳动物体内重编程分化产生视杆细胞，进入视网膜的循环和恢复视功能。

参考文献：Yao,K.etal.Restorationofvisionafterdenovogenesisofrodphotoreceptorsinmammalianretinas.Nature560,484-488(2018).

述评：

遗传性退行性疾病基因治疗的研究是目前全球的科研热点，但随着研究的深入，也相继出现了一些问题。首先，进行基因治疗必须明确患者的致病基因，但目前仍有约1/3的患者致病基因难以确定；第二，与遗传性视网膜疾病相关的候选基因多达几百个，将这几百个基因均进行基因治疗研究会耗费巨大的人力物力，而且花费高额经费研究出来的药物适用人群极少，导致药物价格昂贵，患者无力支付。第三，很多基因由于结构特殊或分子量大并无合适载体能进行有效转染。鉴于以上种种问题的存在，科学家们也在积极寻找另外的治疗途径，其中通过各种方式让光感受器细胞再生是研究的重要方向。本文的作者考虑到Müller细胞也具有干细胞潜能，因此通过重编程的方式将Müller细胞转化为视杆细胞，并且通过完善的科学设计来证明了其确实重建了视细胞的结构和功能，如果此结果能够进一步推进和推广，将来很有可能多种视网膜退行性疾病（如视网膜色素变性、干性AMD、高度近视黄斑萎缩等）都能得到有效的治疗，也开拓了我们科研的思路。