速递：甲状腺激素影响视锥细胞分化

视锥细胞是视网膜重要的感光细胞，主要负责中心敏锐视力和辨色力。根据光谱吸收特性的不同，可以将视锥细胞分为3类：蓝锥细胞（短波长；S）、绿锥细胞（中波长；M）和红锥细胞（长波长；L）。视锥细胞先分化为S或者L/M（图1A），而后向L/M分化的细胞再选择表达L或M视蛋白。影响视蛋白表达或者功能的基因突变会导致多种形式的色盲和视网膜变性。我们通过生物体模型对脊椎动物眼睛的各种机制有了较多了解，但对人类视网膜单独一种视锥细胞亚型的发生机制了解甚少。本文研究者通过干细胞分化视网膜类器官来研究人类视网膜视锥细胞各亚型的机制（图1D-K），研究结果发表在Science杂志上。

A.视锥细胞的分化选择B.人类视网膜中S，L/M细胞的比例C.类器官中S，L/M细胞的比例D-K.iPSC诱导分化为类器官的过程

研究者首先比较了分化的视网膜类器官和成人视网膜组织的视锥细胞亚型特点。发现成人视网膜与分化200天视网膜类器官有相似的视锥细胞亚型构成比（成人，S=13%，L/M=87%；类器官，S=29%，L/M=71%）（图1B和C）；两者比例的差别可能因为视网膜类器官在6个月时还未完全分化成熟。而且视网膜类器官中的S和L/M细胞均表达了CRX（一种感受器分化的关键转录因子）（图2A和E）。另外类器官和视网膜中的视锥细胞形态相似：L/M细胞比S细胞外节部分更长，内节部分更宽（图2B-D，图F-H）。类器官中视锥细胞的外节部分比成人视网膜要短，而这也与出生后视网膜的成熟过程相一致（图2D和H）。因此，干细胞分化视网膜类器官中的视锥细胞在分布、基因表达、形态上均与人类视网膜相似。

在人类视网膜中，S细胞产生于胚胎11-34周，L/M细胞产生于胚胎14-37周，因此研究者又对视网膜类器官视锥细胞的发育进行了研究，首次观察到S-视蛋白表达的时间为150天（图2I，L，M），S细胞的表达水平在170天开始下降（图2M），同时L/M视蛋白开始表达，且表达的量逐渐增加直至第300天（图2K-M）。在人类视网膜和视网膜类器官中观察到视锥细胞的先后表达说明在视网膜发育过程中首先特异性表达S细胞，后转变为特异性表达L/M细胞。接下来研究者又对诱导多功能干细胞（iPSC）起源的视网膜类器官进行RNA测序，发现S视蛋白RNA在第111天开始表达，在第160天表达开始下降，而L/M视蛋白RNA在第160天开始表达并逐渐增加，直到第180天后表达稳定。这些时间节点在类器官和胎儿视网膜中均高度一致，因此类器官的诸多方面均与人类视网膜相似，可以作为一个揭示视网膜感光细胞发展变化机制的模型。

类器官中视锥细胞亚型特征与人类视网膜中相一致，A,C-E,G-M:类器官中视锥细胞的表达B,D,F,H:人类视网膜中视锥细胞的表达L:类器官发育过程中S：L/M细胞的比例M:在类器官发育中S和L/M细胞的密度N:S-视蛋白的表达早于L/M-视蛋白，CRX的表达早于视蛋白。

既往研究表明Thrв2是视锥细胞分化的关键调控分子，但是研究者利用CRISPR/Cas9在胚胎干细胞（ESC）中将Thrв2敲除，但是由此获得的类器官视锥细胞各类型比例与野生型类器官没有差别（野生型，S=62%，L/M=38%；Thrв2KO，S=59%，L/M=41%；P=0.83）（图3A-C）。研究者再次利用CRISPR/Cas9将Thrв（Thrв1和Thrв2）敲除，发现基因敲除的视网膜类器官视锥细胞均分化为S细胞（野生型，S=27%，L/M=73%；ThrвKO;S=100%，L/M=0%；P<0.0001）（图3D,E,H）。在这些突变类器官中，所有的视锥细胞均表达S-视蛋白和表现出S细胞的形态（图3I和J）。因此Thrв是人类视网膜中激活L/M细胞和抑制S细胞的重要作用基因。

Thrв对三碘甲状腺原氨酸（T3）有高亲和力，既往在小鼠实验中改变T3的含量可能会影响视锥细胞的比例。因此研究者假设T3是通过Thrв来影响视锥细胞分化的。在类器官中，在20到50天起开始加入20nMT3，直到第200天，发现视锥细胞大多数均分化为L/M细胞（野生型，S=27%，L/M=73%；野生型+T3，S=4%，L/M=96%；P<0.01）(图3F和H)。说明早期加入T3可促进L/M细胞分化，抑制S细胞。而在ThrвKO的类器官中加入T3,却只有S细胞（野生型+T3，S=4%，L/M=96%；ThrвKO+T3，S=100%，L/M=0%；P<0.0001）(图3F-H).因此T3是通过Thrв来促进L/M细胞分化和抑制S细胞的。

.A.WT类器官视锥细胞B.Thrв2敲除类器官视锥细胞C.WT和Thrв2KO的视锥细胞比例没有差别D：WT类器官视锥细胞E：Thrв敲除类器官视锥细胞F:WT中加入T3的类器官视锥细胞G:Thrв敲除类器官中加入T3视锥细胞H:D,E,F,G中视锥细胞比例的差别I:几种类器官视锥细胞外节部分长度J:几种类器官视锥细胞内节部分长度K:几种类器官视锥细胞的比例差别

接着研究者在类器官发育的过程中对其进行持续的基因表达检测，直到第250天，根据甲状腺激素的表达模式可分为三个阶段：改变表达（图4A），持续表达（图4B）和无表达（图4C），而降解T3和T4的酶的基因DIO3，在早期高表达，而在后期低表达（图4A）。相反，将T4转变为T3的酶的基因DIO2，在早期低表达，而随后表达逐渐增加。因此Dio3和Dio2表达的动态变化支持早期低水平的甲状腺激素信号产生S细胞，而后期高水平的甲状腺激素信号产生L/M细胞。而Thrв的表达也逐渐增加，与视锥细胞的分化相一致（图4A）。而T3/T4的转录因子，辅酶因子也都随着类器官的发育而动态表达（图4A和B）。这些均说明Thrв和其他转录调控因子可以对不同的甲状腺激素水平进行调控反应。促甲状腺激素释放激素（TRH）也在类器官和视网膜中动态表达。因此视网膜是通过内部来调控T3和T4的水平，早期低水平的甲状腺激素信号促进S细胞的分化，晚期高水平的甲状腺激素信号促进L/M细胞的分化（图4A）。

A-C:差异表达基因的热图A:改变表达阶段B:持续表达阶段C:无表达阶段D:DIO3表达下调T3和T4的水平，导致S细胞分化E:DIO2表达将T4转变为T3,启动Thrв信号，抑制S细胞，诱导L/M细胞

综上所述,甲状腺激素信号的动态调节能调控人类视网膜中视锥细胞的分化，这也为以后治疗某些疾病奠定了理论基础。

点评：

近年来有大量的研究工作关注干细胞（如iPSC）作为疾病模型和在潜在治疗方式中的作用，尤其视网膜位于眼内，很难获得活体的细胞或组织用于研究病理机制。目前已有多项iPSC向光感受器细胞、RPE、神经节细胞系分化相关的研究，而且已经可以在体外将iPSC培养转化为和人视网膜相似的三维立体球形视网膜组织，记录到光电反应波、检测到视细胞标记物，甚至包含成熟的光感受器细胞。通过这些研究方法建立生理或病理模型，克服了难以获取患者眼组织的难题，能够有效的研究视网膜发育和疾病的关键调控机制，为将来的治疗提供重要干预靶点。此技术无疑将成为研究视网膜变性疾病的最佳工具。