复制衰老针对眼科的研究

　　复制衰老概念的提出

　　1961年,Hayflick及Moorhead证明了体外培养的人类正常成纤维细胞的寿命是有限的。4年后,Hayflick发现,连续培养的人二倍体细胞株,经过一段旺盛繁殖期(一般不超过1 年) 后,即出现形态变化,停止有丝分裂,直至死亡。Hayflick 将这种正常人体细胞在体外分裂潜能受限制的现象称为细胞衰老,或者更准确地说,复制衰老。这种现象提示:复制衰老可能是生物体生命周期在细胞水平的重演，体外细胞培养中的复制衰老可以反映体内衰老发生的过程。研究发现复制衰老发生的基础是细胞群体倍增次数，而不是时间。复制衰老的特征是细胞周期中G1期不可逆停滞，细胞经多次分裂后，在肿瘤抑制因子p53和Rb作用下，细胞对生长因子等失去反应，产生DNA合成蛋白抑制因子，细胞周期检查点(checkpoint)发送细胞周期停止信号，DNA合成停止，细胞不可逆地停滞于G1期，发生衰老(senescence，M1期)。此时细胞具有一些特征：形态大而扁平，酸性 半乳糖苷酶和多种细胞周期抑制蛋白上调。细胞再经过20～30群体倍增次数(population doublings，PDs)后，进入危机期(crisis，M2．期)，细胞出现退化，LundbergAS等的研究表明这些退化包括双着丝粒形成、染色体变短而失稳，分裂细胞逐渐减少，细胞发生凋亡或死亡[1]。而且许多生理性刺激可以诱导细胞衰老，如持续传代、氧化损伤和原癌基因激活等。

　　复制衰老与端粒

　　Harley于1990年第一个证明了正常细胞衰老时的端粒丢失。他们发现体外培养的人成纤维细胞端粒平均长度以一种复制依赖性方式缩短。这种缩短与体内衰老相关,老年供体成纤维细胞和外周血细胞中端粒平均长度比年轻人短。这些研究提示端粒是有丝分裂计时钟的分子基础和调节机制

　　端粒酶是由RNA(hTER)和蛋白质亚基(hERT)构成的具有逆转录活性的核糖核酶，其特有结构存在于真核生物染色体末端，其功能主要是以RNA为模板，合成串联排列高度保守的六步格重复序列(TTAGGG)，以维持端粒长度的稳定性，它们从核酸外切酶降解和染色体互相融合中交织进稳定的线状同源染色体中。此外，还阻止其它异常形式的染色体重组和附件进入核基质，他们决定了人有丝分裂细胞最大复制能力。因而认为端粒酶与细胞衰老密切相关。端粒酶活性的存在可以抑制细胞衰老、增加体外培养细胞的倍增次数，正常体细胞一般不表达端粒酶，而大部分干细胞如皮肤基底层细胞、造血干细胞、生殖细胞、肿瘤细胞表达端粒酶活性[2]。

　　复制衰老与β2半乳糖苷酶

　　Dimri 等1995 年首次提出了一种可在体内鉴别衰老细胞的生物学标志———β2半乳糖苷酶。他们报道体内或体外的衰老成纤维细胞和角质细胞均表达此酶,而休眠细胞和终末分化细胞则缺乏,永生化细胞中也无此酶的表达。由此提供了衰老细胞在体内衰老过程中存在并积聚的直接证据。

　　复制衰老与氧化应激

　　端粒缩短的随机性是由于后随链合成时末端引物定位的随机误差、端粒的重排和氧化应激造成的端粒DNA单链损伤引起的，其中引物定位误差和随机重排都受到氧化应激造成的端粒DNA位点损伤情况的影响，因此氧化应激通过损伤端粒DNA而加速端粒缩短，从而加快细胞衰老。

　　二.复制衰老在眼科的研究进展。

　　1．复制衰老与晶状体上皮细胞

　　晶状体上皮细胞与皮肤基底细胞来源于同一胚层，具有相似的性质，在一生中处于不断的增殖状态，以形成晶状体纤维细胞，具有干细胞的特性。

　　研究表明，LEC存在端粒酶活性表达，其活性随LEC的增殖传代逐渐减弱直至低于检测水平。体外培养使LEC脱离了体内的微环境，从而失去“干细胞”的特性，细胞向终末表型分化，丧失端粒酶活性。LEC在经过多次传代后细胞形态发生改变，细胞变长，向纤维细胞转化，纤维细胞是LEC分化后的功能细胞。干细胞在体外培养过程中较难保持原有特性的现象在其他细胞系中也可以见到。Matsui[3] 在体外皮肤基底层上皮细胞也观察到类似的现象

　　David[4]等报道在人、牛、兔晶体的实验中，仅有在6个月兔晶体中央上皮组织表现端粒酶活性。在透明和白内障的人晶状体中，人端粒酶逆转录酶(hTERT)活性和表达没有检测到，尽管如此，模板RNA在各种人晶体中都存在。端粒在透明晶体中大概比在白内障晶体中长1kb. 端粒的长度可能与白内障的病因有关。hTERT cDNA引入由G418选择的人晶状体上皮细胞产生了稳定的具有hTERT的人晶状体上皮细胞系。迄今为止在这个细胞系中，hTERT能使经过48次群体倍增后的细胞仍然正常生长并且增强了其对抗氧化应激的抗调亡活性。

　　将hTERT引入晶状体上皮细胞，这使得转染细胞具有端粒酶活性。到目前为止，hTERT在晶状体上皮细胞的表达使得正常生长的转染细胞能群体倍增108代，并且这些细胞在倍增后形态和生长上仍然非常正常。通过合成新的端粒，hTERT阻止复制衰老，并且通过MEK/ERK，蛋白激酶C,蛋白激酶A的调节和最终MEK/ERK信号通道的表达，端粒酶抑制了晶状体上皮细胞的分化。在体内外重建的研究中显示hTERT能形成功能复杂的人模板RNA。hTERT催化亚单位引入端粒酶阴性的正常人细胞能使其端粒伸长和延长细胞寿命。[5]

　　2.复制衰老与角膜

　　1.角膜内皮与衰老

　　在体内角膜，无论供者的年龄，人周边区角膜内皮细胞比中央区有更好的复制能力。年老供者人中央角膜内皮细胞有复制能力，但复制能力比年轻供者中央区细胞要显著降低。减少的复制能力与中央角膜细胞显示的衰老样特征增加相关。[6]

　　2角膜基质与衰老

　　角膜基质主要由200-250层平行排列的纤维小板组成，在这方面研究得较少，但体外研究的衰老皮肤和肺成纤维样细胞中表明有过度表达的胶原酶，弹性蛋白酶，同时，它们的组织抑制金属蛋白酶的表达大幅减少，蛋白多糖合成失败，纤维结合蛋白以另一种细胞粘附效力低的底物形式产生，并且迁移率和成纤维细胞收缩胶原网格的能力也下降[7]。但在衰老的角膜基质中其成纤维细胞表达是否也具有衰老特征尚需实验证实。

　　3.角膜上皮与衰老

　　衰老与广泛生理应激抵抗力降低密切相关。眼表的改变致使老化角膜能更多的被各种原因感染。衰老晶状体上皮的通透性改变表现为晶状体上皮屏障功能下降或泪膜接触时间增多[8]。上皮细胞整联蛋白亚基分布的改变也能降低上皮屏障功能。a6和B4亚基组成半桥粒，随着年龄增加它们变成不连续的。尽管如此，沿着基底膜的半桥粒的数量和分布不随时间改变而改变。角膜细胞上调粘附分子和下调吞噬反应多形核苷酸的能力的发生也与年龄相关。[9]

　　3.复制衰老与视网膜血管内皮细胞

　　由人端粒酶基因表达的视网膜微血管内皮细胞在群体倍增100次后与其它的内皮细胞都有着类似的形态学和生长反应。它表达血管假性血友病因子,一种区别内皮细胞与其它细胞类型的关键标记，在重建的基底膜基质形成血管源性网，并且以VEGF依赖的方式形成小管样三维胶原结构。从端粒和端粒酶的研究中得出端粒酶缩短与细胞衰老的起始相关，因此，异位表达的人端粒酶基因能在视网膜内皮细胞表达，使其绕过第一个细胞周期检查点，但不能绕过第二个细胞周期检查点，因此，使产生的血管内皮细胞寿命延长，但不能使寿命无限制。[10]

　　三．复制衰老与视网膜色素上皮细胞

　　1. 高级糖化最终产物（AGE）与RPE衰老

　　AGE的形成是引发老年疾病的开始。AGEs与许多人体重要疾病的病理生理有联系，它做为调节者，不仅在糖尿病综合症中，在许多年龄相关的病理性疾病中都有重要作用。眼内许多组织细胞都与糖尿病和衰老有关，AGEs被认为是可能的重要视力机能紊乱的调节者。[11]。AGE是一种异质反应产物，由蛋白的主要氨基团和糖类衍生物乙醛基团杂合反应形成。研究表明AGE加速衰老改变的积聚并且引起了早期年龄相关性疾病，包括动脉粥样硬化,白内障，神经变性疾病,肾衰竭，关节炎和AMD. 我们发现AGE积聚在老化的人BM和有免疫功能的基底沉积物中。[12]虽然AGE的荧光在给予D-半乳糖的RPE脉络膜中增加，ERG则显示没有AGE诱导的器官毒性。RPE-脉络膜层增加的衰老超微结构与转录反应的早期炎症、基质膨胀和不正常类脂加工有关，随后，增加的衰老超微结构下调能量代谢基因，上调晶体蛋白基因，并且改变细胞结构基因的表达。[13]

　　2．氧化应激与RPE衰老

　　正常视力要求有功能的RPE-bruch's膜-脉络膜组织来支持视网膜神经感觉层。光氧化应激，光感受器外节脱落，脂质过氧化反应，高代谢作用的要求和需氧量的增加，导致高水平的氧化应激。结果，随着年龄增加，RPE和脉络膜毛细血管内皮细胞形态消失。

　　染色体端粒单链核酸断裂作为一种度量，用来表示在培养的RPE细胞中氧化DNA损伤。细胞终末限制片断(TRF)平均长度在40%氧中比在20%氧中缩短得要快。S1核酸酶测定显示积累的平均TRF长度的缩短是由于增加的单链核酸断裂积聚在末端染色体DNA中。反应氧中介物的产生和血红素加氧酶-1mRNA的诱导在40%氧中比在20%氧中更深，体外培养RPE340细胞在慢性高氧中的生长显示了DNA通过增多的单链核酸在端粒DNA中断裂蓄积而受损伤。这些改变提供了衰老RPE细胞DNA氧化损伤的证据。[14]

　　氧化应激引起细胞结构许多改变，这些结构的改变能改变细胞表现型。为研究氧化应激对细胞功能改变的机制，使用化学氧化剂或高氧的体外模型已经确定。每种氧化剂有不同的急性损伤，因此与体内细胞的关联性仍需研究。用轻度高氧来诱导体外RPE细胞低的、慢性的氧化应激 来模拟体内RPE细胞的环境，结果发现40%氧产生可检测到的氧化应激和诱导适度RPE表型改变，并且伴随着基因表达的改变和染色体DNA的损伤，轻度高氧诱导RPE细胞过早衰老。在40%氧中生长的细胞在群体倍增早期水平就停止增殖，而在20%氧中则相对较晚。增加的SABG阳性细胞和减少的BRDU阳性细胞在40%氧中比在20%氧中更早发育。 [15]

　　3.BRUCH膜与RPE衰老

　　随着年龄增加，RPE和脉络膜毛细血管内皮细胞形态消失。最显著的改变是BM内的沉积物.

　　BRUCH膜中沉积物的定位和合成与年龄相关性疾病有关。但基底部分子水平的结构还没有很好的解决。[16]

　　4．内皮素-1与RPE复制衰老

　　内皮素-1能产生类似视神经病变如青光眼的神经损伤作用。内皮素在眼后极部精确的来源仍然不清楚。目前的研究是确定RPE是否是ET-1局部的来源，衰老RPE细胞的ET-1调节释放与TNF-a调节不同，它的调节释放依靠培养物的衰老程度。RPE可能是ET-1在视网膜的起源，从给予TNF-a后的观察来看，它释放的增加可能在血视网膜屏障破坏中起更重要作用。合成和分泌ET-1在成熟RPE中比在糼年RPE中要多，TNF-a在这两种表现型中都引起了显著前内皮素原-1mRNA水平和ET-1分泌。在用TNF-a后，两种表型中明显出现细胞破裂和紧接着的紧密连接屏障的断裂。[17]

　　5.端粒酶与RPE衰老

　　当端粒变得非常短时，大部分被病毒癌基因转录的正常细胞最后都进入M2期。为了获得无限的生长能力，这些细胞不得不利用端粒酶活性克服M2期。端粒酶表达需要病毒转化的前M2期细胞来防止进入M2危机期。人RPE细胞与猿猴病毒40中T抗原共同转化并且VR3克隆在M2前期已经获得。然后，VR3细胞与包含端粒酶的带菌细胞一起转染并且两种细胞暂时或连续表达的端粒酶被克隆和分别命名为ST1和ST2。正常的RPE细胞在36次群体倍增后进入衰老，虽然在VR3克隆中寿命延长了20多倍，但它最终进入了M2危机期。与正常RPE细胞相比VR3端粒长度减少，并且在传代培养中继续减少。尽管如此，表达T抗原和端粒酶的ST1与ST2克隆能防止这种危象。ST1与ST2原始细胞的端粒长度比正常细胞长。当端粒酶表达减退、伸长的端粒又变短时，ST1再次经受生长抑制，但ST2维持端粒酶活性，端粒长度增殖得以继续。结果，端粒酶活性明确需要克服M2危机期并且获得人体上皮细胞无限的寿命，这个细胞无限增殖化机制是从M1危机逃避中独立出来。[18]

　　6.Beta半乳糖苷酶与RPE细胞衰老

　　应用B-半乳糖苷酶和端粒酶长度检测 ，可以发现培养RPE细胞可以随着传代次数的增加，出现衰老细胞表型的累积，这种累积与RPE细胞中溶酶体活性相关。应用同样的技术，在不同年龄猕猴眼的冰冻切片中也发现衰老细胞随年龄累积的现象 。通常认为培养条件下的RPE细胞在经过30代左右的传代后，细胞增殖能力明显下降，胞体增大，并出现长的突起。10代以内发生复制衰老的RPE细胞<15％ ，而在经过20代以上的传代后，复制衰老的细胞数>70％ ，并出现明显的体积增大，细胞体的不规则突起增多，细胞的增殖能力也明显降低 。但细胞的复制衰老是一种累积性的变化，我们也观察到个别Beta-半乳糖苷酶活性检测阳性细胞仍然可以出现分裂像表型，但明显出现胞体变大、失去多角形态、长的细胞突起明显增多等改变。这些细胞可能在继续培养的过程中完全进入G1期，并停滞在G1期，失去有丝分裂能力，但细胞仍然是存活的，具有一定的生物学活性。同时,在培养的第5代就可以检测到复制衰老细胞的出现，这个现象与其他研究的发现也是吻合的，相关的解释认为，由于后极部的RPE细胞所处的代谢环境明显与周边的细胞不同，因此取材于后极部的RPE细胞提前出现复制衰老的累积特征的可能性要大很多，这个推论也被在体内的RPE细胞复制衰老检测所证实[19]

　　最近的研究表明，人RPE细胞复制衰老不仅表现为beta半乳糖苷酶的染色，还表现为精确的染色体端粒的缩短。从细胞循环中退出的衰老RPE细胞能被溴脱氧尿苷标记，这个结果显示培养的RPE细胞中积聚了beta半乳糖苷酶成阳性的细胞，并作为群体倍增的功能之一。为了研究体内RPE细胞，衰老相关的beta半乳糖苷酶组织化学过程最近被修改了，同样的组织化学过程加上了漂白后染色步骤，这可以使染色的RPE细胞清晰可见。全球第一个改良后研究是在恒河猴中进行，从1岁到29岁，结果显示beta半乳糖苷酶阳性细胞的积聚。