核酸检测准确性欠佳 这个锅该谁背呢

基于实时荧光逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法的病毒核酸检测是目前新冠病毒感染确诊的重要手段。然而，一直有媒体及专家反映，新冠病毒核酸检测的阳性率低，有的病例重复检测多次阴性后又出现阳性结果，咽拭子标本多次检测阴性、但最后在呼吸道灌洗液标本中检测出阳性结果等问题。

为明确这些问题的原因，近日，解放军总医院第一医学中心医学检验中心王成彬主任在《中华医学杂志》在线发表文章《核酸检测用于确诊新型冠状病毒肺炎阳性率低的原因分析》，从患者病程、标本采集、标本运输与保存、标本处理、核酸提取与扩增、病毒核酸变异等方面对影响核酸检测结果准确性的原因进行分析。

目前，无论是临床实验室还是疾病预防控制中心（CDC）实验室，普遍应用的是实时荧光RT-PCR方法进行病毒核酸检测。简单来说，该方法是将标本中的特定核酸序列进行扩增，理论上每一次扩增后的核酸数量都是成倍增加，经过40次以上扩增后，其核酸数量可达到足够通过荧光等常规方法进行检测。

我们应在重视和肯定核酸检测在病毒感染诊断中重要价值的同时，也要客观考虑由于其方法学特点、疾病发展过程、标本采集、标本保存与运输、核酸提取、扩增体系、人员操作等多方面因素都可能造成最后检测结果的假阴性或假阳性。那么，上述因素具体如何影响最终检测结果呢？

病毒存在量是否“达线”

大部分新冠肺炎患者的发病都会经历一个从感染后无症状到轻度症状出现，直至痊愈；少部分患者会发展到严重症状出现的过程。

不同病程、不同病情患者的机体中病毒存在量可能不同，导致已有病毒感染，但由于在相关部位采集不到病毒或采集到的病毒量太少，以至于用现有方法检测不到。

因此，对临床高度疑似新冠肺炎患者，应该连续采集标本进行核酸检测（这可能是临床患者多次检测阴性，阳性结果出现晚的主要原因之一）。其实，任何病原学检测都不能只根据1次阴性结果而做出排除性诊断，更不能根据核酸检测阴性而漏诊临床高度疑似的新冠肺炎患者，尤其在高发地区和大面积流行期间。

标本采集运输是否规范

1.标本采集部位很多专家从实践工作中总结出的经验认为，鼻咽拭子标本核酸检测阳性率高于口咽拭子，下呼吸道采集的痰、肺泡灌洗液标本阳性率高于上呼吸道的口、鼻咽拭子采集的标本（这也是近期被广泛评论的某患者咽拭子标本3次核酸检测阴性，收住院后在抢救过程中采集肺泡灌洗液标本核酸检测阳性的原因）。但是，下呼吸道的痰、肺泡灌洗液标本采集难度太大、易引起患者喷溅导致采集操者感染风险增大。因此，一般情况下，不建议使用（气管切开、呼吸机抢救患者可用）。

《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第五版修正版）》已将标本采集“咽拭子”更新为“鼻咽拭子”。为提高检测阳性率，建议采集同一患者多部位标本，合并进行检测。例如，用口咽拭子、鼻咽拭子同时采集标本，然后放到同一采集管中送检。对于有消化道症状的疑似患者，可同时采集粪便或肛拭子进行检测。

2.标本采集方法采样的准确性存在操作者个人的依赖性。如果标本采集者操作不规范，也会导致采样误差。如果平时医护人员咽拭子取样不多，刮取标本时患者的反应又比较大，往往导致刮取标本的位置不对，或力度和时间不够，没有刮取到带病毒的标本或刮取到的带病毒标本量少，最后检测结果阴性率必然增加。

3.标本运输及保存新冠病毒很容易被来自试剂、耗材等外源性或细胞破坏后所释放的内源性RNA酶降解，而影响最后的检测效率。

严格来讲，标本采集后应及时送到实验室（疾控中心、医院检验科、第三方实验室），尽快完成检测。

标本在常温下放置时间过长也可能造成最后检测结果假阴性。

虽然，我们可以使用防病毒核酸降解的标本采集管，但目前此类产品数量少、成本高、实际应用效果尚需要进一步评价。因此，我们建议标本采集后应及时送检，及时检测（4小时）。

检测环节是否标准化

1.核酸提取方式前面已述及新冠病毒的核酸检测需要对所采集标本的核酸进行提取。

目前，实验室较常用的提取标本核酸的方法为手工提取和核酸全自动提取仪提取。

手工法实验过程由于人员等因素难以做到标准化；全自动核酸提取仪法在整个过程中需使用配套的核酸提取仪及相应的试剂，整个操作易于标准化。

相比于手工法，核酸全自动提取仪可避免一些手工操作容易出现的差错，对于检测结果影响较小。

而不同提取试剂和手工提取流程的掌控对最后提取到的核酸数量和质量可能存在差别。与此同时，从标本中所提取出的核酸数量和质量对于检测方法中下一个步骤的核酸扩增至关重要，从而直接影响最后的检测结果。

2.核酸扩增环节由于不同厂家的试剂研发是根据新冠病毒核酸OFR1ab、N、E等基因的特异性序列设计的扩增探针（不同厂家的扩增试剂可分为1个、2个或3个靶标基因位点检测试剂），而包含有不同靶标基因位点的试剂检测敏感度、特异度不同，试剂中酶、金属离子等成分与质量的差异等，也都可能影响扩增效率和最后的检测结果。

3.试剂研发与应用由于导致本次疫情的是一种新型病毒，加之疫情的突发性，试剂生产商只能根据有限公开的病毒核酸研究数据来开展试剂研发。

国家相关部门最早推荐了一些厂家的检测产品，后来又审批了多个厂家检测试剂的注册申请。试剂生产厂家不同，核酸检测试剂盒的质量参差不齐，也会影响检测结果。

目前，开展新冠病毒检测试剂研发生产的厂家已超过百家。正常情况下，一个临床检测试剂产品从研发到应用需要通过一系列的临床验证与评估，但由于本次疫情的特殊性，时间紧迫，因此，研发试剂来不及完成常规流程，特别是无法得到一定数量的临床患者标本的验证。

有些厂家只能用新冠病毒目标RNA序列通过噬菌体蛋白外壳包裹等方式模拟真实标本中的病毒进行验证。因此，对于临床某些高度疑似病例，或检测结果难以确定病例，建议用2种以上试剂进行检测、验证。

近期，中华医学会检验医学分会组织了相关方面专家对新冠病毒核酸检测工作进行了探讨，并出台了核酸检测相关专家共识，同时一些新的基因检测平台也在不断研发。随着基因测序、数字PCR、RTPCR毛细管电泳等技术的应用，新冠病毒核酸检测中的问题一定会得到持续改进。