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细胞培养时如何减少乳酸积累?

摘要:乳酸脱氢酶(LDH)是一种糖酵解酶,存在于机体所有组织细胞的胞质内,是催化丙酮酸生成乳酸重要的酶。通过下调LDH-A的含量可以有效降低细胞培养过程中乳酸的积累,这点在众多的文献中均已得到证实。

CHO细胞是目前用于单抗的生产最广泛的细胞株,用以培养CHO细胞的培养基含有丰富的营养物质,如葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素等,部分营养物质会被转化为细胞毒性的代谢废物(乳酸、铵等)。铵的积累不仅会影响细胞的生长和蛋白产量,还会改变蛋白的糖基化修饰;同样,乳酸的产生会降低培养体系的pH,为调节pH而添加的碱液及高浓度的乳酸本身导致体系渗透压的增加,进而影响到细胞成长和蛋白产量与质量。笔者在此将促进乳酸代谢的一些策略进行了简单总结,可分为基因工程、添加物添加和培养策略改变。

LDH
 
乳酸脱氢酶(LDH)是一种糖酵解酶,存在于机体所有组织细胞的胞质内,是催化丙酮酸生成乳酸重要的酶。通过下调LDH-A的含量可以有效降低细胞培养过程中乳酸的积累,这点在众多的文献中均已得到证实。SooMinNoh等在GS筛选体系中运用shRNA技术构建了低表达LDH的细胞株CHO-K1LDHsi、GSKOLDHsi,与对照细胞组CHO-K1、GSKO相比,其乳酸的累积明显降低,如图1所示。
 
在此研究中对其他代谢参数的改变也进行了探讨,如铵的积累,基因改造细胞株也较对照组要低些,这可能要归功于GS筛选系统本身的优势。这种下调LDH表达量的技术不会影响到单抗的产量,Soo团队在对单抗的质量属性分析中发现LDH下调对糖基化具有影响,但不会影响到聚体与电荷异质性。但其并不推荐在GS系统中实行下调LDH的基因工程技术,因其会影响到GS系统的筛选能力。还有一点也是值得注意的,完全的LDH基因去除对CHO细胞是致命的。
 
图1LDH下调细胞株CHO-K1LDHsi(白色圆形)、GSKOLDHsi(白色方形),和其对照CHO-K1(黑色圆形)、GSKO(黑色方形)的乳酸累积比较(来源于参考文献1)
 
PYC2
 
丙酮酸羧化酶(pyruvatecarboxylase,PYC2)重组表达是哺乳动物细胞中常见的降低乳酸形成的策略,PYC2是糖异生循环中重要的限速酶,参与将乳酸、丙酮酸、氨基酸及甘油转化生成葡萄糖的催化,因此PYC2在CHO细胞中的高表达可以加速对乳酸的消耗。
 
Toussaint等在CHO细胞中成功构建了高表达PYC2的克隆,其团队将带有PYC2基因片段的质料pTT18尝试导入129株CHO克隆,从中选取了11株PYC2-positive克隆进行后续的实验。不论是检测到的乳酸含量、体系的pH变化、又或是细胞VCD和VIA,实验数据均表明PYC2-positive组均较对照组和PYC2-nagetive组消耗了更多的乳酸。同时将这11株PYC2-positive克隆在5种常用的商业培养基中进行试验,得到了相同的实验结果,与对照相比其乳酸含量总是较低些。
 
Toussaint团队还在批培养和补料分批培养中对PYC2-positive克隆(11号克隆)对乳酸降解的情况进行了验证,结果如图2所示。11号克隆的peakVCD几乎超过对照组的两倍,后期乳酸也被消耗。值得关注的是当使用11号克隆进行Fed-batch实验时,乳酸开始消耗时葡萄糖的含量还维持在40mM,即PYC2-positive克隆对乳酸的降解不受葡萄糖浓度的限制。
 
铜离子
 
培养基成分始终是细胞培养中重要的一环,其中微量元素铜离子曾在多种CHO细胞中被证实可以促进细胞生长及减少乳酸积累。SenXu等在ambr15微反应器中进行了相关实验,其在基础培养基中添加了不同浓度的硫酸铜(1×?200×),并在D4和D6分别进行了补糖操作。结果见图3,通过比较D4和D6补糖后硫酸铜实验组和对照组间细胞密度与乳酸含量的变化,可知铜离子的添加可促进细胞对乳酸的消耗及细胞生长。
 
究其生化层面的原因,铜离子是细胞色素c重要的辅因子,而细胞色素c参与线粒体膜上电子的传递过程,细胞色素c的多寡与铜离子直接相关。研究表明,线粒体氧化能力降低会造成高浓度的乳酸积累,而铜离子缺失会影响线粒体功能及代谢能力进而扩大乳酸生成路径。铜离子的加入可能扩大了线粒体的氧化容量,从而降低了乳酸的累积。另外,铜离子添加会影响到单抗的质量,如增加碱性峰的比例、降低高甘露糖型水平等。
 
葡萄糖
 
用其他代谢缓慢的糖类代替葡萄糖的策略也是降解乳酸的途径之一,其中半乳糖是研究较多的一种。用半乳糖、岩藻糖、甘露糖和麦芽糖作为第二碳源对乳酸积累的影响见图4,除甘露糖外其他糖类的添加均可降低乳酸的积累;当以半乳糖代替葡萄糖时细胞活率出现快速下降,这是因为细胞对半乳糖的降解速率缓慢,为避免这种情况可考虑将其他糖类与半乳糖共同使用。
 
低糖消耗乳酸也是细胞培养时常见的策略。早期的一项研究表明,高浓度的葡萄糖会导致高浓度的乳酸积累,限制葡萄糖及谷氨酰胺浓度后乳酸的含量也得到限制,但对于两者的最低浓度范围还没有定论。Yogender等研究了30mM和10mM的葡萄糖对细胞生长和乳酸代谢的影响,其结果如图5,虽然低浓度葡萄糖的细胞密度较高浓度葡萄糖低,但其乳酸含量也低些,证明低糖确实有利于乳酸降解。
 
同时,研究员还通过RNA-Seq技术对CHO细胞中的27629个基因进行了分析,其中10090个基因在两种不同浓度葡萄培养时表达,而只有575个基因表达量具有区别。更精确的分析表明,涉及糖酵解、TCA循环和糖基化的基因在两种不同浓度葡萄糖时均没有超过2倍的表达量区别,也就是说控制低浓度的葡萄糖对单抗的糖基化影响不大。但有研究指出低浓度的葡萄糖会影响糖基化的位点,这可能也与细胞株有很大联系。
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