肠道菌群与大肠癌发病风险的相关性研究

　　大肠肿瘤是常见的消化系统恶性肿瘤，近年来随着人们生活方式与饮食习惯的改变，大肠癌的发病率和死亡率均呈上升趋势[1]。虽然关于大肠癌发病机制的研究不断深入，但其确切病因仍不明确。目前关于肠道菌群状态与大肠癌发病的研究日益受到关注，多项研究发现肠道菌群状态与大肠癌的发生密切相关[2]。因此，研究肠道菌群的变化，对于了解其在大肠癌发病中的作用以及寻找大肠癌最佳治疗方法具有重要意义。但目前研究多集中于肠道菌群在大肠癌发生、发展中的作用[3，4]，对于大肠癌患者、大肠腺瘤患者及正常人群肠道菌群的分类和定量研究还较少。本研究采用荧光定量聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）对研究对象的肠道菌群进行分类和定量研究，以明确肠道菌群的变化，为研究肠道菌群状态与大肠癌发生、发展的相关性提供依据。

　　1、资料与方法

　　1.1、一般资料

　　1.1.1、大肠癌组

　　将2015年1月至2016年3月于本院就诊的45例大肠癌患者纳入大肠癌组，纳入标准：①符合大肠癌诊断标准[5]，并经肠镜及病理学检查确诊；②年龄40～80岁；③预期生存期＞3个月；④无结直肠手术史；⑤未经过辅助放化疗及手术治疗；⑥身体状况良好，未合并心、肝、肾及血液系统疾病；⑦无特殊饮食习惯；⑧对本研究知情同意。排除标准：①长期腹泻患者；②曾接受结直肠放疗患者；③家族性腺瘤性息肉病（familialadenomatouspolyposis，FAP）或遗传性非息肉性大肠癌（hereditarynonpolyp-osiscolorectalcancer，HNPCC）患者；④炎性肠病（inflammatoryboweldisease，IBD）、糖尿病或肥胖等代谢性疾病患者；⑤近1个月内曾服用抗生素、皮质类固醇、质子泵抑制剂等药物患者。入选患者中，男27例，女18例；年龄42～72岁，平均（61.7±6.6）岁；根据美国肿瘤联合会（AmericanJointCommitteeonCancer，AJCC）/国际抗癌联盟（UnionforInternationalCancerControl，UICC）第7版TNM分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期17例，Ⅲ期14例，Ⅳ期5例；肿瘤位置：盲肠2例，升结肠4例，降结肠3例，乙状结肠11例，直肠25例。

　　1.1.2、大肠腺瘤组

　　将2015年1月至2016年3月于本院就诊的62例大肠腺瘤患者纳入大肠腺瘤组，纳入标准：①符合大肠腺瘤诊断标准[5]，并经肠镜及病理学检查确诊；②未合并心、肝、肾及血液系统疾病；③无结直肠手术史；④对本研究知情同意。排除标准：①长期腹泻患者；②IBD、FAP、代谢性疾病（糖尿病、肥胖等）患者；③近1个月内曾服用抗生素、皮质类固醇、质子泵抑制剂等药物的患者。入选患者中，男37例，女25例；年龄40～73岁，平均（63.2±7.1）岁；腺瘤类型：管状腺瘤32例，绒毛状腺瘤8例，管状-绒毛腺瘤16例，锯齿状腺瘤6例。

　　1.1.3、对照组

　　将2015年1月至2016年3月本院体检中心健康体检者60例纳入对照组，纳入标准：①年龄40～80岁；②无消化道慢性疾病史，常规体检及粪便常规检查均无异常；③留取粪便标本前1个月内未使用抗生素或微生态抑制剂；④对本研究知情同意。排除标准：①合并心、肝、肾及造血系统功能严重损害者；②病历资料不完整者；③妊娠期或哺乳期女性；④合并精神疾病者。入选研究对象中，男35例，女25例；年龄40～76岁，平均（60.7±8.2）岁。三组研究对象一般资料比较均无显著差异（P＞0.05），具有可比性。

　　1.1.4、标本采集

　　分别收集三组研究对象新鲜大便，以天平称取中段大便，每份3g，存放于无菌离心管中，-80℃冰箱保存备用。

　　1.2、实验仪器及试剂

　　1.2.1、实验仪器

　　离心管（德国Eppendorf公司）、低温高速离心机（德国Eppendorf公司）、超净工作台（苏州净化设备有限公司）、-80℃超低温冰箱（美国ThermoForma公司）、核酸蛋白检测仪（德国Eppendorf公司）、PCR扩增仪（美国BIO-RAD公司）、电泳仪PowerPAC3000（美国BIO-RAD公司）、凝胶成像分析系统GelDoc2000TM（美国BIO-RAD公司）、荧光定量PCR仪ABI7300（美国ABI公司）、荧光定量PCR仪LightCycler2.0（瑞士罗氏公司）。

　　1.2.2、实验试剂

　　普通DNA产物纯化试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）、琼脂糖（美国Introvergen公司），DNA提取液（北京天根生化科技有限公司）、RNA酶抑制剂（北京天根生化科技有限公司）、OligodT18（北京天根生化科技有限公司）、脱氧核糖核苷三磷酸（deoxynucleotidetripho-sphates，dNTPs）（北京天根生化科技有限公司）、PowerSYBR?GreenPCRMasterMix（美国ABI公司），DNA分子标准Marker（加拿大Fermentas公司）。其他试剂：焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate，DEPC）、乙醇、氯仿、异丙醇、氯仿-异戊醇（24︰1）均为国产分析纯。

　　1.3、方法

　　1.3.1、引物的设计与合成

　　[6]参照文献研究设计双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、梭菌属、梭杆菌属等引物，并以局部序列比对基本检索工具（basiclocalalignmentsearchtool，BLAST）在线核实其特异性后，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

　　1.3.2、粪便DNA的提取[7]

　　取0.5g粪便样本加入10ml磷酸盐缓冲液（phosphatebufferedsaline，PBS）（0.1mol/L）充分混匀，置于10ml离心管中，离心半径225px，3000r/min离心5分钟，取上清液，并重复上述离心操作3次后，取1ml上清液加入1.5ml离心管中，离心半径350px，12000r/min离心10分钟，弃上清液，于沉淀中再加入上述上清液，重复4次，收集沉淀。将预处理后收集的沉淀以磁珠击打破碎细胞后，采用酚/氯仿抽提纯化法提取DNA，以核酸蛋白检测仪检测DNA浓度及A260/A280。并采用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像分析系统观察DNA片段大小和完整性。

　　1.3.3、实时荧光定量PCR反应

　　PCR反应体系20μl：实时荧光定量PCRMasterMix（2×）10μl，上游引物（10μmol/L）1.0μl，下游引物（10μmol/L）1.0μl，cDNA模板（300ng/μl）2.0μl，加DEPC补足至20μl。将反应体系瞬时离心，上机循环。PCR循环参数：95℃预变性10分钟；95℃变性20秒，57℃双歧杆菌退火（58℃乳酸杆菌退火、59℃大肠杆菌退火、60℃粪肠杆菌退火、61℃屎肠杆菌退火、59℃拟杆菌属退火、60℃梭杆菌属退火、61℃梭菌属退火）10秒，68℃延伸40个循环，74℃延伸30秒。

　　每次试验均设标准品与阴性对照，反应完成后粪便标本所含细菌的拷贝数由LightCyclerPCR仪分析其循环阈值（Ct值），并与标准曲线比较，求得分辨样本菌群的定量结果。

　　1.3.4、标准曲线的制作

　　取对照组研究对象分辨基因组DNA，分别用不同细菌的特异性引物进行扩增，25μl反应体系：buffer（5×）4μl、dNTPs（10mmol/L）2μl、MgCl22.5μl、上游引物1.0μl、下游引物1.0μl、Tap酶（2.5U/μl）0.4μl、模板DNA2.0μl、最后加DEPC至25μl，以94℃预变性5分钟、94℃变性40秒、57.2℃细菌退火30秒、72℃延伸1分钟40个循环、72℃后延伸5分钟，置-20℃保存。

　　取PCR反应产物6μl与溴酚蓝2.5μl混匀上样，用2.0%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结束后采用凝胶成像系统摄像，并将出现目标条带的扩增产物采用DNA纯化试剂盒进行纯化，之后用核酸蛋白检测仪测定目标基因浓度及OD260/280值。根据吸光度值与片段长度的关系计算基因拷贝数（copies/ml），然后将其稀释成（10～109）copies/ml，用作标准品；将纯化产物20μl及粪肠球菌上、下游引物各10μl送由南京凯基生物技术公司进行测序，并对纯化产物进行荧光定量PCR，根据读取的荧光数据，由系统软件自动分析Ct值，并生成标准曲线。

　　1.4、统计学方法

　　采用SPSS20.0软件对数据进行统计分析。标本定量数据以x±s表示，研究对象各组数据比较采用方差分析，大肠癌与菌群相关性研究采用等级相关分析。检验水准设定为α＝0.05。

　　2、结果

　　2.1、部分样本的基因组DNA电泳情况

　　对本研究提取的部分样本的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳后，结果如图1所示。

　　2.2、各组研究对象肠道菌群水平比较

　　大肠癌组患者双歧杆菌、乳酸杆菌水平均明显低于大肠腺瘤组和对照组（P＜0.05），大肠杆菌、屎肠球菌、梭菌属水平均明显高于对照组（P＜0.05），粪肠球菌、拟杆菌属、梭杆菌属、脆弱拟杆菌、单形拟杆菌、多形拟杆菌、卵形拟杆菌、吉氏拟杆菌、普通拟杆菌、坏死梭杆菌、肉毒梭菌、艰难梭菌水平均明显高于大肠腺瘤组和对照组（P＜0.05）；大肠腺瘤组双歧杆菌、乳酸杆菌水平均明显低于对照组（P＜0.05），大肠杆菌、粪肠球菌、梭杆菌属、梭菌属、脆弱拟杆菌、单形拟杆菌、多形拟杆菌、卵形拟杆菌、吉氏拟杆菌、普通拟杆菌、坏死梭杆菌、肉毒梭菌、艰难梭菌水平均明显高于对照组（P＜0.05）（表1）。

　　2.3、肠道菌群与大肠癌发病的相关性分析

　　双歧杆菌和乳酸杆菌与大肠癌发病呈负相关（P＜0.05），大肠杆菌、粪肠球菌、拟杆菌属、梭杆菌属、梭菌属、脆弱拟杆菌、多形拟杆菌、普通拟杆菌、坏死梭杆菌、艰难梭菌与大肠癌发病呈正相关（P＜0.05）（表2）。

　　2.4、肠道菌群与大肠癌TNM分期的相关性分析

　　双歧杆菌和乳酸杆菌与大肠癌TNM分期呈负相关（P＜0.05），大肠杆菌、拟杆菌属、梭杆菌属、脆弱拟杆菌与大肠癌TNM分期呈正相关（P＜0.05）（表3）。

　　3、讨论

　　肠道内细菌与宿主具有紧密的代谢关系，一旦肠道菌群失调，则会导致代谢紊乱，从而引发疾病。本研究通过应用荧光定量PCR对大肠癌患者、大肠腺瘤患者及正常人群的粪便样本的菌群进行了定性定量研究，准确测定了肠道细菌的变化。结果显示，大肠癌组患者双歧杆菌属和乳酸杆菌属水平均低于大肠腺瘤组和对照组，大肠杆菌、粪肠球菌、拟杆菌属水平均高于大肠腺瘤组和对照组。这提示大肠癌患者肠道菌群出现微生态失调，与国内外文献研究一致[8-10]。Mira-Pascual等[11]研究发现，结直肠癌患者、管状腺瘤患者与健康人群菌群结构不同，结直肠癌组织中存在较多的核酸杆菌和肠杆菌，这也提示结直肠癌的发病与菌群失调有关。付文政等[12]通过16SrRNA基因克隆文库方法与454测序法比较大肠癌、大肠腺瘤患者及正常人群的肠道菌群，发现三组研究对象菌群结构存在差异，这也说明了肠道菌群结构与大肠癌的关系。本研究中，菌群失调主要为有益菌的减少与有害菌的增多，表现为大肠癌患者粪便中厌氧菌与需氧菌的比值下降，即双歧杆菌与大肠杆菌的比值下降。Rafter等[13]研究发现，结直肠癌患者中肠道菌群出现微生态失调，双歧杆菌/大肠杆菌的比值降低，结直肠癌患者术后出现双歧杆菌与大肠杆菌比值倒置现象。本研究还发现，大肠癌组患者拟杆菌属、梭杆菌属、梭菌属水平均高于对照组，这与Kostic等[14]研究结果一致。研究发现，拟杆菌属、梭杆菌属、梭菌属的致癌作用是通过其产生的致癌物质或前致癌物质而引起的[15-18]。

　　本研究发现，双歧杆菌和乳酸杆菌与大肠癌的发病呈负相关，大肠杆菌、粪肠球菌、拟杆菌属、梭杆菌属等与大肠癌的发病呈正相关，更进一步证实了肠道菌群失调对大肠癌发病的影响。将菌群水平与大肠癌分期进行相关性分析，发现肠道菌群与大肠癌的发展具有相关性，与文献研究一致[6，19，20]。

　　综上所述，肠道菌群对大肠癌的发生、发展具有重要作用。但本研究样本量较小，并未研究肠道菌群改变对大肠癌发生、发展的机制。因此，今后应加大样本量，进一步开展试验研究以探索肠道菌群在大肠癌发生、发展中的机制。