微滴式数字PCR技术进展

　　微滴式数字PCR技术进展

　　1、技术核心原理

　　dPCR核心原理如下：将含有核酸分子的反应体系处理为纳升级的微滴，使每个微滴含或不含待检靶分子，且每个微滴都作为一个独立的PCR反应器，经PCR扩增后采用微滴阅读仪逐个对微滴进行检测，并以终点信号的有或无作为判断标准（有荧光信号的微滴判读为“1”，无荧光信号的微滴判读为“0”）。最后，根据泊松分布原理及阳性微滴的比例，利用分析软件计算待检靶分子的浓度或拷贝数，从而获得最终结果。

　　域值循环数（cyclethreshold，Ct）是实时荧光定量PCR的重要概念，是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。对实时荧光定量PCR和dPCR的原理进行比较后可以发现，dPCR通过统计学原理直接给出靶序列的起始浓度，其结果不再依赖于Ct值[1]，可以避免实时荧光定量PCR在低拷贝靶分子、细微模板浓度差异中灵敏度和精确度相对较差的缺陷。

　　2、技术发展历史

　　1999年，美国约翰?霍普金斯大学Ludwig中心的Kinzler和Vogelstein等[2]通过纯手工操作将直肠癌患者粪便样品基因组DNA稀释并等分至384孔微量滴定板的各个孔中，然后通过PCR扩增，结果在超过100个孔中发现了基因组DNA，其中4个显示出KAS基因突变。这一研究被认为是dPCR理念的开端之作。此后，研究人员开始从操作简化及检测便捷等方面对系统进行了优化，并开发出了下列3种样品分散模式：

　　（1）磁珠模式：主要包括以96孔板、384孔板甚至1536孔板作为分散反应的载体模式，以及利用“小珠、乳浊液、扩增、磁性”为主要操作流程的磁珠乳液扩增法（Beads，Emulsion，Amplification，Magnetics，BEAMing）。但上述两种方法无论在分散程度和数据群体的体量方面均无法达到更加精细的要求。

　　（2）微滴模式：微滴模式是随着纳米制造技术（nanofabrication）、微流体技术（microfluidics），特别是二代测序技术发展起来的新模式，因此dPCR通常也被称为“微滴式数字PCR（dropletdigatilPCR，ddPCR）”。

　　QuantaLife公司最早开发了ddPCR平台。2011年，Bio-Rad公司收购了QuantaLife公司后更名为QX100?微滴式数字PCR仪[3]。2013年，升级为QX200。2012年，RainDance公司推出了Raindrop型号设备，这一设备可以将每个标准反应体系分割为包含100万至1000万个皮升级别微滴的反应乳液，从而获得超高的微滴数目。

　　（3）芯片模式：1997年，Kalinina等[4]应用纳升级芯片进行了单克隆模板PCR扩增。2013年，LifeTechnologies公司推出了最新型号的QuantStudioTM3D数字PCR系统。该系统可以使样本均匀分配至2万个完全单独隔离的反应孔中，能够在尽可能简化操作步骤的同时有效防止交叉污染，并有效避免了微滴式系统可能面临的管路堵塞问题[5]。

　　3、数字PCR的主要应用

　　ddPCR具有诸多优点[6]，近年关于以ddPCR为核心技术平台的报道越来越多，本文将对其中几个主要领域的应用情况进行介绍。

　　3.1、突变位点检测（mutationdetection）

　　随着个体化治疗理念的深入推进，突变基因检测及突变位点癌细胞比例分析越来越受到个体化治疗研究人员的重视和关注。研究表明，循环肿瘤DNA（circulatingtumorDNA，ctDNA）是实体瘤治疗效果和预后评估的重要监测指标之一，而高筛查能力、多分子检测则是ctDNA应用于临床需要迫切解决的关键技术问题[7，8]。2013年，Hindson等[9]在NatureMethod发表文章，首次将ddPCR和实时荧光定量PCR在分析微小RNA（miRNA）表达水平的重复性进行了系统的统计学比较，证明了ddPCR技术可于不同情况下准确、可重复性地定量检测血浆和血清miRNAs，并为miRNAs及其他核酸用于循环生物标志物的检测提供了更多依据。

　　表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）的T790M突变被认为是EGFR-酪氨酸激酶抑制剂（tyrosinekinasinhibitor，TKI）耐药性产生的重要原因。吉非替尼（如易瑞沙）和厄洛替尼（如Tarceva）是TKI的典型代表。多项研究表明，ddPCR在EGFR相关突变检测方面具有显著优势[10-13]。Watanabe等[11]利用dPCR建立了一种具有超高检测敏感性的EGFR突变检测方法。Oxnard等[14]对9例接受厄洛替尼一线治疗的非小细胞肺癌患者的血浆ctDNA进行了检测，结果显示，6例患者中检出T790M突变；随着治疗周期的延长，突变浓度呈递增趋势，且在时间上较影像学确认的肿瘤恶化提前了16周。Zheng等[13]利用ddPCR开展了一项研究，证实非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药患者ctDNA中的EGFRT790M突变是一种不良结局的预测因子[13]。Isobe等[15]也证实，通过dPCR可以高效检出肺腺癌患者癌组织、复发肿瘤组织以及血清游离DNA中的T790M突变，且复发灶T790M突变阳性患者原发灶突变频率远高于阴性患者。

　　Reid等[16]采用dPCR研究了恶性黑素瘤患者循环肿瘤细胞中BRAF基因V600E和V600K突变，结果表明，dPCR在灵敏度上高出实时荧光定量PCR200倍，检测下限为0.0005%，表明dPCR高灵敏度检测的强大优势。

　　伊马替尼是一种BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂，可用于BCR-ABL阳性慢性粒细胞白血病的分子靶向治疗。Mori等[17]研究发现，利用dPCR可以非常有效地预测伊马替尼治疗慢性粒细胞白血病的复发率。

　　3.2、基因表达分析

　　长期以来，如何对多等位基因拷贝数变异（multi-alleliccopynumbervariation，mCNV）进行准确的遗传学分析是困扰科研人员的难题之一。2015年，NatureGenetics报道了Hand-saker等[18]在这一领域的突破性进展，他们通过全基因组测序和ddPCR证实，人与人之间90%已观察到的基因拷贝数差异均属于mCNV。这一研究也从技术层面证实，ddPCR是一个非常有效的、可用于mCNV精确分析的技术平台。

　　因样本中含有大量PCR反应的抑制物及无法找到合适的定量标准物质等原因，石蜡包埋组织、血液、粪便、食品、土壤等样本的基因分析往往较困难。而dPCR可以完美解决上述问题[19-21]。Dingle等[22]系统比较了十二烷基硫酸钠（sodiumdodcylsulfatesodiumsalt，SDS）、乙二胺四乙酸二钠及肝素等常见PCR抑制物对ddPCR和实时荧光定量PCR的影响，结果显示，ddPCR对SDS和肝素的耐受程度远高于实时荧光定量PCR。姜羽等[23]、Witwer等[24]、Morisset等[25]研究均证实，ddPCR的灵敏度、重复性均优于实时荧光定量PCR，具有实时荧光定量PCR无可比拟的优势。

　　Ferracin等[26]利用Bio-Rad公司的QX200TMddPCR系统，确定了多种癌症患者的血浆和血清样本中关键miRNA分子的绝对水平，他们通过比较癌症患者和健康个体的数据证实miR-181a-5p有望成为乳腺癌的标志物。

　　3.3、高通量测序结果的验证与深入

　　高通量测序技术与ddPCR的联合表现在下述两方面：

　　（1）高通量测序技术中样品制备流程和针对低含量核酸分子的成单分子测序对ddPCR系统革新具有重要的推动作用，这也是ddPCR技术不断创新发展的重要基础。

　　（2）数据量大、可拓展性强是高通量测序的主要特点，但这也造成后续结果分析困难、验证难度大以及假阳性率高的缺陷。dPCR对二代测序结果的高性能验证和分析可以为后续研究的准确性奠定坚实基础。Boettger等[27]首先通过高通量测序技术对人17号染色体的17q21.31区域进行了深入分析，之后采用dPCR对结果进行了大样本量的验证，结果显示，dPCR的结果与高通量测序数据高度吻合，相关性＞99%。目前，dPCR与高通量测序、“阵列”联用来进行CNV位点发现及确认已经逐步成为一种标准化流程[3]。

　　3.4、病原学研究

　　ddPCR由于其绝对定量的特点在病毒的核酸检测中也有很好的应用前景。

　　“功能性治愈”是人类免疫缺陷病毒/艾滋病（HIV/AIDS）领域非常重要的临床概念。2013年，Richman等报道了一项具有里程碑意义的研究成果：HIV感染患儿出生30小时后便开始接受组合式抗逆转录病毒治疗，29天后患儿HIV常规检测结果呈阴性；随后，应用dPCR技术分别于出生后第24个月和第26个月对患儿血液中HIVRNA水平进行了反复检测，结果仅能发现部分HIVRNA片段，未检测到具有复制能力的HIV。在该项研究中，dPCR发挥了关键作用。目前，dPCR应用于HIV相关核酸检测的报道越来越多，重点应用的仍然是其灵敏度和绝对定量两方面[28-30]。

　　乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV）慢性感染是导致原发性肝癌发生的重要原因。HBV共价闭合环状DNA（covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA）仅存在于被感染的肝细胞核内，拷贝数极低，被认为是HBV感染慢性化及抗病毒治疗停止后复发的最主要原因，也是目前HBV药物研究的核心靶点之一。2015年，Mu等[31]采用基于绝对定量的dPCR对HBVcccDNA进行了检测，结果发现，dPCR的检测灵敏度可达单拷贝水平；基于dPCR的核酸检测能够对HBVcccDNA实现灵敏并精确的定量。此外，由于HBV表面抗原突变和低病毒载量等原因，原发性肝癌组织标本中的HBV相关研究较为困难。Huang等[32]利用dPCR检测了福尔马林固定后石蜡包埋的肝癌组织标本中的HBV特征，结果证实，dPCR能够高效地检出此类标本中的HBVcccDNA，其线性范围良好，具有很好的研究示范价值。

　　魏飞力等[33]评价了dPCR在HCVRNA定量检测中的应用价值，特别是其对低拷贝HCVRNA的定量检测能力，结果提示，dPCR在线性范围、精密度、准确度和检测灵敏度方面均表现良好。目前临床检测中的HCVRNA定量试剂可以直接应用于dPCR中，但其检测结果，特别是极低检测下限在临床中的实际应用价值尚需进一步研究。

　　3.5、无创产前诊断

　　无创DNA产前检测（noninvasiveprenataltesting，NIPT）是一项非常具有应用前景，但目前仍处于尝试阶段的产科诊断平台。通常所谓的DNA产前检测技术是指通过高通量测序技术对母体外周血浆中的游离胎儿DNA（cell-freefetalDNA，cffDNA）进行测序，再通过测序结果的生物信息分析获得胎儿遗传信息的方法。一般认为，cffDNA是胎盘细胞凋亡的结果，最早可在妊娠5周时检测到，其浓度随着孕周增加而增加[34]。

　　由于cffDNA数量极少，能够在多少拷贝的水平顺利实现DNA或RNA分子稳定检出是影响其临床应用前景的关键性技术问题。传统的基因组DNA大多采用商品化的核酸提取试剂盒进行。2013年，Holmberg等[35]比较了konniBiosystems公司的TruTip核酸提取技术和QIAGEN公司的CirculatingNucleicAcids试剂盒对于cffDNA提取的效果，结果显示，TruTip试剂盒对片段化的cffDNA提取率较QIAGENò试剂盒提高了约87%，且定量PCR结果与ddPCR结果相关性良好。这一结果也为ddPCR用于产前诊断提供了成功的范例。目前，还有更多的类似研究和应用正在开展[36]。

　　位于5q13的SMN1基因和SMN2基因是脊髓性肌萎缩（spinalmuscularatrophy，SMA）的致病基因，其中SMN2基因拷贝数的准确检测是SMA诊断的重要依据内容。Zhong等[37]首先成功应用dPCR技术对SMA样本进行了SMN2基因拷贝数的检测。Stabley等[38]也利用dPCR技术开展了针对SMN1和SMN2基因拷贝数的精确检测，结果提示，该技术可以精确检测0～3拷贝的SMN1基因和0～5拷贝的SMN2基因，且变异系数分别仅为1.6～3.7%和2.1～2.7%，其检测下限和变异度均远低于实时荧光定量PCR技术。Tsui等[39]应用dPCR和相对突变剂量方法对血友病关键致病基因F8基因或F9基因杂合性突变携带孕妇进行了研究，结果提示，dPCR在以血友病为代表的X-连锁遗传性疾病检测中具有非常好的检测性能。此外，dPCR在镰状细胞性贫血和22q11.2微缺失综合征等疾病诊断方面的研究尚在不断开展和深入过程中。

　　dPCR作为一项新的技术，还有许多问题需要进一步探讨，包括技术本身以及应用方面。相信随着应用的深入，ddPCR技术一定会以更好的性能在生命科学领域发挥更多、更好的作用。