易解离化合物的pKa、离子型、分子型及其HPLC保留特征

　　一、化合物pKa的估算与初步测定

　　一、pKa

　　酸性物质的pKa是酸解离常数的负对数，碱性物质的pKa是其共轭酸解离常数的负对数。

　　了解酸或碱性物质的pKa值，可以方便的计算出药物在不同pH溶液中分子型（未解离型）和离子型(解离型)组分比例，对于我们建立和优化色谱条件具有重要意义。

　　容易得到，对于酸性物质：

　　对于碱性物质：

　　根据我们以前的推论：

　　K’、KI’、Kf’分别为总容量因子、离子型容量因子和分子型容量因子。

　　由此可见，分子型和离子型的比例，直接决定了化合物的保留，尤其是在KI’和Kf’相差较大的时候。

　　二、pKa估算

　　一般药物的pKa都可以从文献上获得，对于不能从文献获得的，可以进行初步估算。

　　(1)酸pKa估算

　　酸性药物一般以含羧基的居多。

　　当羧基与烷基连接时pKa一般在在4~5之间，如甲酸、乙酸和丙酸的pKa分别为3.8、4.7和4.8。

　　当含有吸电子基团，酸性增强，pKa相应降低，可参考氯乙酸（pKa2.9），羟基乙酸（pKa3.8)粗布估算。

　　当羧基与芳环连接时，pKa一般在3~6之间，可以苯甲酸（pKa4.2）为基准，根据苯环上取代的位置和取代基团进行估算。如水杨酸（邻羟基苯甲酸）pKa=3.0。

　　(2)碱pKa估算

　　碱性药物一般为脂肪胺、芳胺和含N杂环类化合物，对于羧酸盐类，可以运用其相应羧酸的pKa进行计算。

　　脂肪胺：pKa一般在9~11之间，如甲胺、乙胺、三乙胺pKa分别为10.6、10.8、11.1。

　　当含有吸电子基团，碱性降低，pKa相应降低，可以三乙醇胺（pKa=7.8）、乙二胺（pKa1=9.9）为参考。

　　芳胺：可以苯胺（pKa4.6）为基准，根据苯环上取代的位置和取代基团进行估算。如水杨酸（邻羟基苯甲酸）pKa=3.0。

　　N杂环：可以母核为基准，根据取代基团的性质和未知估算：

　　脂肪胺类碱性较强，要完全抑制它们的质子化，pH需要达到11~13以上，普通色谱柱难以承受如此高的pH，需要使用耐高pH值色谱柱。在普通色谱柱承受的pH范围内，它们几乎都以离子型（完全质子化）存在。

　　芳胺pKa在普通色谱柱承受的pH范围内，调节流动相pH即可调节保留。

　　N杂环化合物中，吡嗪、吡咯、吲哚、噁唑、异噁唑碱性极弱，几乎不解离，流动相可以不加缓冲盐；其它pKa也多在普通色谱柱承受的pH范围内，调节流动相pH即可调节保留。

　　三、pKa和初步测定

　　文献上有多种测定化合物pKa的方法，本文介绍一种HPLC测定pKa的方法。以酸性物质为例，介绍测定方法的原理。

　　根据式（1）我们知道，在流动相pH远小于pKa（差值不低于2）时，酸性物质99%以上以分子型存在，此时测得的容量因子即可作为分子型的容量因子(kf’)。同理，可以在流动相pH远大于pKa（差值不低于2）时测定出离子型的容量因子（kI’)。

　　在流动相选择中间pH条件下，测定化合物k’。由于kI’、kf’已经测出，根据式（3）即可以计算出xI和xf，将它们和流动相的pH代入式（1）就可以计算出化合物pKa。

　　以下为苯甲酸pKa的测定示例：

　　色谱条件：

　　色谱柱：SB-C18(4.6*150mm,5um）

　　流速：1.0ml/min

　　测试波长：240nm

　　柱温：30℃

　　进样体积：10uL

　　供试品溶液：0.1mg/ml（流动相溶解）

　　流动相：缓冲液-ACN（80：20）

　　测定结果如下：

　　pH2.1时可以认为苯甲酸解离被抑制，此时的k’可以作为分子型的kf’，pH7.2时可以认为苯甲酸完全解离，此时的k’可以作为离子型的kI’，即可以认为kf’=6.88，kI’=0。

　　pH4.4时，k’=xIkI’+xfkf’=3.77，由此计算xf=0.55，xI=1-xf=0.45，分子型与离子子型比值为1.22。

　　根据式（1）即算出pKa=4.5，该值与文献值4.2基本吻合。

　　二、一个峰还是两个峰？离子型和分子型的相伴相生

　　对于在流动相中易离解的化合物（比如酸和碱），离子型和分子型的极性通常相差很大，那么他们在HPLC中是否会被分离为离子型和分子型的两个色谱峰呢？

　　事实上，这个问题可以用酸碱平衡理论解释。下面以酸性物质（HS）为例，看看它们在色谱柱中的色谱行为：

　　HS在流动相中存在下列离解平衡：

　　HS→H++S-

　　如果HS解离常数为Ka，则有：

　　Ka=[H+][S-]/[HS]

　　即：[S-]/[HS]=Ka/[H+]

　　如果保持流动相中[H+]恒定（使用缓冲溶液），[S-]/[HS]也将恒定。这说明在谱带上任何一点，离子型和分子型比例都是恒定的。也就是说分子型和离子型相伴以恒定的比例流出色谱柱，出现的色谱峰是分子型和离子型的叠加。分子型的峰型和离子型的峰形始终保持一致，相伴相生。

　　上述结论是建立在以下两个前提之上的：

　　(1)离解平衡迅速达到。

　　(2)流动相中[H+]恒定；

　　通常酸碱解离都能达到快速平衡。通常情况下，使用合适缓冲盐即可使流动相中[H+]恒定。但如果缓冲容量超载（组分酸碱性过强、进样量过大、缓冲盐选择不合适、缓冲液浓度过低），由于谱带上各点被分离组分浓度存在差异，无法保证每一点离子型和分子型比例都保持恒定，导致出现峰变形甚至分裂。

　　对于碱性物质，同理也可得到上述结论。事实上，对于流动相中存在二次平衡的物质的分离，都可按同样思路进行分析。比较典型的离子是糖的色谱分析，糖分离过程中存在α型和β型互变：

　　α型→β型

　　只要平衡足够快，我们就会得到一个尖锐和几乎对称的色谱峰，但事实上该互变平衡较为缓慢，导致色谱峰型变宽甚至分裂。因此糖分离中通常使用氨基柱和采用高柱温，希望快速达到互变平衡（碱性条件和高温能加速达到平衡）。

　　类似的例子还有乙酰乙酸乙酯在流动相中的二次平衡（酮式和烯醇式互变），甚至离子对色谱法也存在诸多二次平衡。

　　三、易离解化合物的保留

　　我们知道，离子型组分极性大，容量因子小，保留低，分子型组分极性小，容量因子大，保留大。那么，对于一个在流动性中易解离的化合物（酸或碱），它的保留情况如何呢？

　　还是以酸性物质（HS）为例，在色谱柱中同时存在离解平衡和分配平衡：

　　Kf、KI分别为分子型和离子型在固定相和流动相中的分配系数：

　　按分配系数定义，组分（离解型和分子型之和）在固定相和流动相中总分配系数K为：

　　将（1）（2）代入（3）得到：

　　XI、Xf分别为离子型和分子型占比，XI+Xf=1。

　　两边同时除以相比得到：

　　K’、KI’、Kf’分别为总容量因子、离子型容量因子和分子型容量因子。该式显示，总容量因子为各状态组分所占比例与该状态容量因子乘积之和。显然，通常情况下Kf’＞＞KI’，故分子型占比越多，总容量因子越大，保留越强。

　　根据解离常数可以得到：

　　显然，流动相pH比组分pKa小2时，分子型与离子型之比达到100，组分几乎均以分子型存在，总容量因子贡献几乎全部来源于分子型，保留也最强。流动相pH比组分pKa大2时，离子型与分子型之比达到100，组分几乎均以离子型存在，总容量因子贡献几乎全部来源于离子型，保留也最弱。

　　（4）式和（6）式同时给我们优化色谱条件带来更多选择，即可以仅通过调节流动相pH改变分子型和离子型比例来改变组分的保留值。

　　对于碱性物质，我们也可以按上述方法得到相同结论。