大环内酯类药物在中性粒细胞型哮喘中的治疗作用

 【关键词】支气管哮喘；大环内酯类；中性粒细胞；炎症表型；治疗。

支气管哮喘是一类以气道高反应性和可变性呼气气流受限为主的慢性气道炎症异质性疾病，约5～10%可发展为重症哮喘，医疗资源耗费巨大，病死率高。根据诱导痰细胞比例可分为四种炎症哮喘表型[1]：嗜酸粒细胞型(eosinophilicasthma,EA)、中性粒细胞型(neutrophilicasthma,NA)、混合粒细胞型(mixedgranulocyticasthma，MA)及寡粒细胞型(paucigranulocyticasthma,PA)。根据气道炎症表型分类可更好地指导哮喘治疗及判断预后[2]。NA多以诱导痰中性粒细胞比例≥40～76%[1,3]为标准。约50%的患者气道以中性粒细胞浸润为主。NA主要与呼吸道急慢性感染、环境污染、肥胖、衰老、吸烟、应用大剂量糖皮质激素等因素有关，是重症哮喘的一类重要表型[4]。重症NA特征为老龄、吸烟，常见于多次气管插管病史、突发性致死性等重症哮喘[5]。与EA相比，NA具有更差的临床表现、肺功能及较多的急性发作次数，且尚缺乏有效的治疗措施。

大环内酯类药物(Macrolidedrugs,MD)除抗菌作用外还具有潜在的抗病毒、抗炎和免疫调节作用。一些临床试验发现MD对非嗜酸粒细胞型哮喘（主要是NA）有积极作用，然而长期应用MD的安全性是诸多临床医生担心的问题。本文就目前中性粒细胞型哮喘的发病机制、大环内酯类药物的作用机制等方面进行综述。

1中性粒细胞型哮喘的发病机制

目前认为NA属非Th2细胞驱动的炎症反应，涉及微生物群改变、气道中性粒细胞、固有免疫细胞系统及Th17/Treg细胞免疫反应等多个方面。

1.1微生物群定植及感染

气道微生物群的变化在人体气道慢性炎症中发挥重要作用。哮喘患者呼吸道的流感嗜血杆菌属、奈瑟菌属、金黄色葡萄球菌属和链球菌属多见，且细菌负载量大[6]、气道反应性高。支气管反应性与某些有助于哮喘发生的菌群丰度有关[7]。早期口咽部链球菌属、卡他莫拉菌、流感嗜血杆菌的定植可明显增加哮喘的发生[8]。NA的呼吸道微生物群组成较EA存在差异，其菌群种类减少，而流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、变形杆菌增多，这种改变可能影响抗菌素、激素的反应，增加肺部感染的风险[9]。

肺炎支原体、衣原体等非典型病原体急慢性感染可能在激素抵抗的NA中有重要作用。在难治性哮喘及哮喘急性发作的患者中，肺炎支原体、衣原体存在率约15～65%[10]，其感染可阻止支气管上皮细胞纤毛运动，感染肺巨噬细胞、单核细胞，产生更多的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8。与喘鸣症状相关的感染还包括呼吸道合胞病毒（RSV）、人鼻病（hRV）、人变性肺病毒、副流感病毒和冠状病毒。80%的成人及儿童哮喘的急性发作均确认存在病毒感染。

1.2中性粒细胞的作用

在重症哮喘和哮喘急性发作的患者中，气道中性粒细胞增多更明显，与气道中性粒细胞相关趋化因子增多、中性粒细胞抗凋亡增加及清除受到损伤有关。促进中性粒细胞由循环进入肺组织的趋化因子主要有IL-8、TNF-α和白三烯B4（LTB4），IL-8水平与中性粒细胞数明显相关。高剂量激素的使用可抑制中性粒细胞凋亡，而且中性粒细胞在炎症刺激下可通过自身和机体释放的ATP提高生存活性。中性粒细胞的清除通常由巨噬细胞吞噬，但哮喘患者巨噬细胞的吞噬能力明显下降。

活化的中性粒细胞可分泌IL-6、IL-8、IFN-γ、GM-CSF等一系列细胞因子加重炎症反应[11]。中性粒细胞还可释放MMP-9、MPO、弹性蛋白酶等，参与哮喘气道重塑。通常情况下，中性粒细胞受到微生物的刺激可产生活性氧，其氧自由基具有杀菌作用，但哮喘患者的中性粒细胞活性氧功能受到不同程度的抑制，不容易将病原菌彻底清除。然而轻度哮喘患者中性粒细胞活性氧的产生更明显，可导致哮喘的加重及气道重构[12]。

1.3固有免疫系统的激活

固有免疫系统是人体对抗有害刺激的第一道防线。炎症复合体（又称炎症小体，inflammasomes）是固有免疫的多种蛋白复合体，激活后引起前IL-1β裂解，释放IL-1β，启动急性期促炎反应。NA患者痰固有免疫受体—Toll样受体TLR2、TLR4和CD14，同促炎因子IL-8、IL-1β基因表达均升高，且NLRP1、NLRP3、NLRC4炎性小体在NA患者中表达升高，与IL-1β水平上调一致[13]。IL-1β的激活直接诱发Th1/Th17免疫反应和气道中性粒细胞浸润。

IFN-β、IFN-λ与宿主抵抗感染有关。有学者认为NA固有免疫系统激活是气道微生物定植的结果，NA患者痰中IFN-β、IFN-λ/IL-29和干扰素刺激基因（ISG）过度表达，反映了NA固有免疫的激活[14]，而另一研究则发现NA患者外周血（PBMC）体外经鼻病毒刺激后产生较少的IFN-α，IFN-β[15]，反映了NA患者气道与外周血细胞的差异。

1.4Th17/Treg失衡及低Th2/Th17内型

一般认为Th17/Treg细胞失衡在NA中发挥重要作用。Th17细胞由原始CD4+T细胞在IL-6、IL-8、IL-23、TGF-β共同刺激下分化产生[16]，以分泌IL-17为特征，Treg细胞可抑制Th2、Th17细胞活化。活化的Th17细胞释放IL-17A、IL-17F，刺激哮喘动物气道上皮细胞合成CXCL1和IL-8等趋化因子，导致中性粒细胞性气道炎症[17]。Treg细胞诱导气道免疫耐受的机制可能与表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）分泌IL-10、TGF-β等细胞因子有关[18]。NA患者CD4+T细胞向Th17细胞分化增强，向Treg分化减弱，即Th17/Treg比例失衡。

另外，T细胞的分化具有异质性，在特定的微环境影响下可再分化为同时具有两种Th标志的细胞，包括Th2/Th17、Th1/Th17、Th1/Th2细胞等。Th2/Th17细胞可同时分泌IL-4和IL-17，多见于严重EA（迟发型EA）或MA患者，有学者将哮喘分为高Th2、高Th2/Th17及低Th2/Th17三种内型，并将NA归为低Th2/Th17型[19]，其具体机制尚待进一步阐清。

1.5炎症反应

NA患者的CRP、IL-6和弹性蛋白酶显著升高[20]。系统性炎症的基因表达与高BMI、更长的吸烟史、更低的用力肺容积（FVC）%预测值以及痰中性粒细胞数增加相关[21]。Baines等学者采用哮喘患者外周血基因表达对炎症表型分型，发现NA患者的DEFA（α-防御素）1,1B,3,4，CTSG（中性粒细胞组织蛋白酶）和ELA2（弹性蛋白酶）均明显升高，提示NA的炎症反应是与其他表型相鉴别的特征[22]。

2大环内酯类药物在中性粒细胞型哮喘中的作用机制

大环内酯类(MD)是一类多效性药物，其主要临床功效为抗菌、抗炎和免疫调节作用。目前认为只有14、15元环具有抗炎作用。长期口服小剂量MD治疗弥漫性泛细支气管炎、囊性肺纤维化、支气管扩张症等慢性气道炎症疾病的疗效显著，而针对哮喘的疗效及机制研究仍存争议，很大程度上与哮喘的异质性有关。

AZISAST研究显示[23]，非EA（尤其是NA）严重哮喘组阿奇霉素治疗后可明显减少哮喘发作次数，改善生活质量。2015年的Meta分析[24]的亚组结果显示，MD或有益于非EA患者。2016年Andrea等的真实世界研究[25]发现MD相较于喹诺酮类、头孢菌素等抗菌素，可减少严重哮喘患者急性发作的风险。其作用机制可从以下几方面进行分析：

2.1抗微生物方面

MD可有效清除包括支原体、衣原体、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌等常见呼吸道病原菌。MD主要聚集在细胞内，包括中性粒细胞、巨噬细胞等，随中性粒细胞渗入炎性组织中，虽不能清除铜绿假单胞菌，但低剂量即可降低对上皮细胞的粘附性，抑制胞外多糖藻酸盐的形成和鞭毛动力，进而影响群体感应蛋白和生物膜形成[26]。亚抑制浓度的红霉素可抑制铜绿假单胞菌凝集素、血细胞凝集活性、胞外蛋白酶和溶血活性等，可能与抑制铜绿假单胞菌毒力和细菌死亡有关。MD还可通过增加干扰素产生和ISG的表达，减少支气管上皮细胞的病毒复制和生长[27]。

2.2对中性粒细胞的影响

MD可高浓度的聚集于中性粒细胞的胞浆溶酶体颗粒中，有稳定溶酶体的作用。予标准剂量后，阿奇霉素在人中性粒细胞内长达28d的大量滞留可致其脱颗粒和吞噬作用相关的氧化爆发的启动，进一步增强抗菌活性。该药物为时间双相性，促进宿主初始防御，稍后减轻组织损伤并缓解炎症。其急性抑制作用包括下调趋化因子IL-8、GRO-α、MPO，晚期作用包括减弱中性粒细胞氧化爆发、下调MPO、增加中性粒细胞凋亡，以及通过抑制NF-κB和活化蛋白-1（AP-1）的活性来减弱中性粒细胞趋化反应[28]。阿奇霉素还通过抑制多形核白细胞和单核细胞中的前列腺素合成酶（COX-1和COX-2）的表达抑制PGE2合成。MD比皮质类固醇、地塞米松、PDE4抑制剂、罗氟司特和p38激酶抑制剂具有更广泛的抑制炎性因子和趋化因子释放的作用。

2.3对固有免疫细胞及系统的作用

在肺泡巨噬细胞中，MD通过抑制AP-1减弱LPS诱导的促炎因子的产生，抑制花生四烯酸的释放和代谢[29]，还可增加吞噬作用，抵抗氧化应激。MD可减弱LPS或IFN-γ刺激巨噬细胞后的Th1细胞反应，活化的巨噬细胞极化为M2表型，介导Th2反应和炎症后修复[30]。MD以浓度依赖的方式显著抑制M1型巨噬细胞标志物（CCR7,CXCL11和IL-12p70）的基因表达和/或释放，并增强M2型巨噬细胞标志物（IL-10和CCL18）和单核细胞的表达和/或释放标记CD163。MD抑制LPS刺激的DC细胞共刺激因子（CD40和CD86）和MHC-II类分子的表达，并减弱TLR-4和IL-12的表达[31]。Lin等发现[32]在IL-15刺激的人NK细胞中，阿奇霉素通过下调穿孔素表达来抑制细胞毒性作用。

2.4对气道上皮细胞屏障的保护作用

Halldorsson等研究发现[33]，阿奇霉素能够在铜绿假单胞菌的毒力因子诱导上皮细胞通透性时保持其完整性和上皮阻力，结合粘附分子（包括紧密连接蛋白），还伴有粘蛋白分泌减少、p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径信号转导改变、细胞因子（IL-6、IL-8，MMP-1、2、9、10、13，GM-CSF）水平下降，并影响脂质代谢和细胞周期。TGF-β可诱导多种上皮细胞凋亡，且已被证实通过激活caspase-3和下调Bcl-2增强人支气管上皮细胞的凋亡。研究证实[34]阿奇霉素可通过改善Bax/Bcl-2比值失衡和抑制气道上皮细胞Caspase-3水平缓解气道上皮细胞凋亡。MD还可通过抑制上皮细胞MUC5AC基因表达和蛋白生成以及阻断氯离子通道抑制水分的分泌等，减少气道黏膜的分泌。

2.5对适应性免疫的作用

MD对T淋巴细胞分泌细胞因子如IL-2、4、5、6、8、10，IFN等有干预作用，可以纠正Th1/Th2细胞的失衡。罗红霉素可抑制抗原刺激后病人T淋巴细胞的增殖，抑制IL-4、IL-5生成，提高IFN-γ的含量。Ding等[35]研究发现小剂量的克拉霉素可下调Th1细胞特异性转录因子T-bet及IFN-γ的表达，抑制Th1细胞的分化，且通过下调Th17细胞特异性转录因子ROR-γt及IL-17的表达，阻断Th17细胞的分化，从而达到降低Th1细胞及Th17细胞介导的炎症反应。另有学者在小鼠中性粒细胞型哮喘模型中发现[36]，克拉霉素联合地塞米松治疗后，其IL-17降低并恢复相对HDAC2活性与气道阻力和炎症相关，提示克拉霉素的使用可减少中性粒细胞型哮喘患者激素的用量。另外，罗红霉素可以诱导表皮螨粉活化的淋巴细胞凋亡。Fas/FasL系统的诱导以及Bcl-2表达减少和罗红霉素促进淋巴细胞凋亡有关[37]。

3、总结

NA以气道中性粒细胞性炎症为特点，在气道微生物群、气道中性粒细胞作用、固有和获得性免疫反应等方面存在着不同的发病机制。越来越多的临床证据支持MD对NA的有效性，MD的抗菌、抗炎和免疫调节的多效性发挥了重要作用。目前已有部分国家的哮喘指南推荐MD可作为治疗重症NA的附加药物。然而，一些实际问题亟待解决：首先，长期口服小剂量MD可致呼吸道微生物耐药性增加，尚缺乏对机体长远影响的研究；其次，MD可否纳入中性粒细胞型重症哮喘的常规治疗还需更多的临床证据支持；第三，明确慢性感染（支原体、衣原体）的哮喘表型是否更具有个体化治疗的意义；第四，新的非抗菌性MD的临床作用及应用前景尚待开发。