[名刊]KCNJ11突变与常染色体显性遗传的早发2型糖尿病发病相关

　　摘要

　　目的/假设：超过90%的中国家族性早发2型糖尿病遗传病因未明。为探索其分子病因学，我们发现并描述KCNJ11基因突变是否为这些家族糖尿病的致病原因。

　　方法：筛查96例家族性早发2型糖尿病先证者及其家族的KCNJ11基因突变，并通过生理学研究、分子模型构建及人群调查对新发现突变的功能意义进行确认。

　　研究结果：在3个早发2型糖尿病家系中分别发现3种新的KCNJ11突变即：R27H、R192H和S116F117del突变。体外研究结果显示，携带KCNJ11基因R27H或R192H突变的钾离子通道其ATP敏感性显著降低（E23K>R27H>C42R>R192H>R201H），但在携带功能缺失性突变S116F117del的ATP敏感性钾离子通道中未检测到电流。分子模型提示R192H对通道的ATP结合域的作用比R27H更强，这可能是“R192H突变ATP敏感性比R27H突变低7倍”的原因。S116F117del突变通道的外形因两个氨基酸的缺失而受到压缩，这可能是突变通道没有电流的原因。对携带R27H或R192H突变的患者停用胰岛素改用磺脲类药物治疗、对携带S116F117del突变患者持续使用或转用胰岛素治疗都能取得良好的血糖控制效果。

　　结论/解释：该研究结果表明，对家族性早发2型糖尿病进行KCNJ11突变的基因诊断有助于理解这些特殊类型糖尿病的分子病因学，并为之提供更加个体化的治疗。

　　引言

　　青少年成人起病型糖尿病（MODY）是由原发性胰岛β细胞功能障碍引起的单基因突变型、常染色体显性遗传、非自身免疫性糖尿病的早发类型。目前，已经确定了十多种MODY致病基因。家族性早发2型糖尿病的临床表型通常以胰岛素抵抗为特征，这与MODY不同，而与晚发2型糖尿病相似。有研究显示，KCNJ11的杂合激活突变不仅是永久性新生儿糖尿病（PNDM）的病因，而且可引起MODY和成人发病型糖尿病的发病。这一结论去年在一个法国MODY基因阴性家系中已得到再确证，该研究提议定义KCNJ11基因为MODY13。

　　KCNJ11基因位于染色体11p15.1，是一个编码由390个氨基酸组成的内向整流型钾离子通道Kir6.2蛋白的开放阅读框。Kir6.2蛋白包括2个假定的跨膜区片段和一个环型孔区域H5（图1a）。ATP敏感性钾通道（KATP）通过耦联细胞代谢与钾离子跨膜运动，控制细胞的电信号转化。胰岛β细胞KATP通道由4个成孔的Kir6.2亚单位和调控通道门控的磺脲类受体SUR1两种成分构成。KATP通道对ATP敏感且能被磺脲类药物抑制，后者是一种广泛用于治疗2型糖尿病且通过将细胞代谢状态同膜电位相耦联而调控胰岛素分泌的药物。研究发现，KCNJ11的突变（如E227K）和变异（如E23K）与糖尿病发病相关。在Kir6.2基因敲除大鼠中，葡萄糖和甲苯磺丁脲诱导的胰岛素分泌、细胞膜去极化和钙离子β细胞内流均存在缺陷，这表明胰岛素分泌调节依赖于KATP通道的活性。在Kir6.2G132S转基因大鼠出现高血糖前，可观察到大量的β细胞凋亡，这提示KATP通道在β细胞生存中亦发挥重要作用。

　　我们筛查了96个MODY基因突变阴性、呈常染色体显性遗传的早发2型糖尿病家系先证者及其家族的KCNJ11基因突变，在此报道与MODY基因突变阴性、呈常染色体显性遗传的2型糖尿病相关的三种新KCNJ11基因杂合型突变。

　　研究方法

　　糖尿病家系先证者及其家族成员的招募在上海市糖尿病研究所、上海市临床医学中心募集家系进行2型糖尿病的遗传学研究。简而言之，如果家族成员的2型糖尿病传递模式与常染色体显性遗传一致，即将其纳入。此外，同意参加研究的家族成员（患或不患糖尿病均可）应达到一定数目。入选家族的筛查标准为：①至少有一名先证者（2型糖尿病诊断年龄<40岁，范围在12~39岁间）；②先证者在一开始的两年接受饮食控制或口服降糖药物治疗；③至少3代人患有糖尿病；④先证者不携带线粒体DNA3243A→G突变：根据Fukui等人描述的PCR-RFLP方法（使用ApaI内切酶）检测该突变；⑤先证者不携带以下6种MODY基因即HNF4α/MODY1、GCK/MODY2、HNF1α/MODY3、PDX1/MODY4、HNF1β/MODY5和NeuroD1/BETA2/MODY6基因的突变。突变的检测使用之前报道的、修正PCR-直接测序法进行确认。应用多重连接依赖的探针扩增法（MLPA）未检测出96例早发2型糖尿病先证者存在上述六种MODY基因片段的缺失。开始实验前，我们已募集并检测了96个中国汉族家系，测量了家系成员的身高、体重和血压，并采血以提取基因组DNA；同时检测其血糖、甘油三酯、总胆固醇、HbA1c、C肽和胰岛素等生化指标。对非糖尿病对照者及接受口服降糖药物治疗或饮食控制的糖尿病患者行75g葡萄糖OGTT试验，采集2h后血样以检测血糖、C肽和胰岛素水平。另外，对正接受胰岛素治疗的患者检测其空腹血清C肽。

　　根据以下标准选取109例非糖尿病对照者：年龄≥65岁（年龄73.2&plusmn;5.7岁；BMI21.1±2.4kg/m2）、葡萄糖耐量正常、HbA1c<5.6%（38mmol/mol）、无糖尿病家族史。所有研究对象均完成了医疗和家族史问卷，使用来自医疗记录中的信息进行补充。采用美国糖尿病协会（ADA）的标准诊断糖尿病和糖耐量受损（IGT）。

　　对所有患者均进行标准的临床与实验室评估。使用125I标记的GAD65和125I标记的IA-2放射免疫沉淀试剂盒，根据制造商推荐的实验步骤检测血清GAD抗体和IA-2抗体。每种抗体分析阳性的标准为指数>1.0（高出正常对照平均值2个标准差[SD]）。使用RIA试剂盒测定血清胰岛素和C肽水平。对胰岛素的检测与人类胰岛素原的交叉活性极低（<2%）。使用自动分析仪采用酶法检测甘油三脂和总胆固醇。

　　本研究中所有患者的GAD抗体、IA-2抗体及3243A→G点突变均为阴性。本研究经过了上海交通大学附属第六人民医院伦理委员会批准，并取得了所有试验参与者的知情同意书。

　　KCNJ11基因测序使用2对引物对KCNJ11整个编码序列和侧翼序列进行测序（上游引物：5’-CGAGAGGACTCTGCAGTGAG-3’，下游引物：5’-GCTTGCTGAAGATGAGGGTC-3’和上游引物：5’-CATCGTGCAGAACATCG-TG-3’，下游引物：5’-TAACACCCTGGATGAGCAG-3’）。

　　在GeneAmpPCR体系的9700热循环仪上进行PCR反应：使用以上两对特异性引物，经95℃预变性5min，随后进行30个95℃变性1min、58℃退火1min、72℃扩增1min的循环，而后进行10min最终的扩增。使用QIAquickPCR纯化试剂盒对扩增的DNA进行纯化，而后使用特异引物及BigDye终止循环测序试剂盒从PCR产物两端进行测序。在ABIPRISM3100遗传分析仪上进行毛细管电泳，使用ABIPRISM测序软件3.7版进行序列分析。将含整个基因编码序列的PCR产物克隆入TA克隆载体，通过测序以确证这3种突变的序列。使用序列导航软件将测得的序列与公开发表的序列（NM_000525.3）进行比对。在家系其他成员中检测新突变与糖尿病共分离遗传的情况，在109例汉族非糖尿病对照个体中检测新突变、变异的存在情况及频率。

　　参数连锁分析使用LINKAGE软件包子程序MLINK对基因型数据进行2点连锁分析计算。假设为常染色体显性遗传，疾病-基因频率为0.0001，外显度为80%。

　　三种KCNJ11突变体的构建之前已有含人类KCNJ11和ABCC8整个编码区域的质粒在哺乳动物中表达的研究报道。将人类KCNJ11cDNA亚克隆进入pCMV载体中，再使用辅助噬菌体R408构建一种单链pCMVKCNJ11模板。使用位点定向突变生成法构建表达含R27H、R192H或S116F117del突变的质粒。

　　细胞培养和DNA转染在添加10%FBS的DMEM培养液中培养COS-1细胞。对于单通道的记录，将1×105个细胞置入35mm培养皿中，按照操作指南，使用Lipofectamine2000将携带野生型ABCC8的1.5μmol/LpCMV6c和携带野生型或突变型KCNJ11（R27H、R192H或S116F117del）的1.5μmol/LpCMV6b转染入上述细胞；将编码绿色荧光蛋白的pEGFP-N1作为报告基因，行共同转染。在进行电生理记录前进行48～72h的细胞培养。

　　电生理实验使用精确调整的膜内外钳夹设备，按照以前描述的方法对单通道电流进行记录。使用pCLAMP和内置软件联合对单通道电流进行分析。使用Axopatch200B膜片钳夹放大仪对野生型和突变型通道的ATP敏感性进行检测。磺脲类药物敏感性估算为使用100μmol/l甲苯磺丁脲前后KATP通道电流强度的比值，对野生型（n=15）及突变型（Kir6.2R27H/SUR1，n=10；Kir6.2R192H/SUR1，n=9)通道进行实验。结果以均数±SE来表示，使用Mann-WhitneyU检验（通道的可检测率）或Student’s不配对t检验进行统计学显著性检验。

　　Kir6.2模型的构建为进一步探讨上述突变对Kir6.2功能的影响，研究者以Kir2.1的晶体结构为基础构建了Kir6.2的C端模型。这些蛋白的N端结构域有53.1%的序列一致性，序列使用ClustalX进行排列。同源模型使用CPHmodels-2.0Server和swiss-模型构建。Kir6.2模型是以细菌内向整流型K+通道（KirBac3.1；PDBentry1U4F）及大鼠Kir3.1通道（PDBentry1X6L）胞内结构域的晶体结构为基础构建。Kir通道的跨膜区（TM）具有高度的保守性。KirBac3.1和大鼠Kir3.1TM之间的保留水平为36%，这表明KirBac3.1的跨膜区是Kir3.1片段TM的一种合适模型。TM区模型是一种对称相向的4倍体。该模型的3个片段（TMs、N端和C端）分别独立构建而后组合在一起。该结构与之前报道的一种结构相类似，是删掉SUR1的Kir6.2截短蛋白。然而这种预测的Kir6.2模型是假定的，尚需要进一步的验证。当然，内向整流型钾通道Kir6.2亚单位的成孔通道同源模型的构建可为突变的作用提供合理的解释。

　　研究结果

　　遗传解析在这些MODY基因突变阴性的家系中共发现6个KCNJ11变异，其中3种是已知的单核苷酸多态性（SNP）（E23K[rs5219]、A190A[rs5218]和I337V[rs5215]），另外3种是新发现的突变（c.80G>A，p.R27H；c.575G>A，p.R192H和c.348-353delCTTCTC，p.S116F117del）（图1a）。96例先证者及109例无血缘关系的非糖尿病对照者中，3种SNP（E23K[rs5219]、A190A[rs5218]和I337V[rs5215]）的频率分布相似（分别是39.1%vs.38.5%、43.7%vs.46.8%和40.0%vs.38.5%）。3个新突变分别在3个先证者及其家系中测得，但在其他家系先证者及109例非糖尿病对照者中未检测到，这提示上述突变并非单纯的多态。

　　突变钾通道的生物信息学和功能学分析家族a的先证者在27号密码子发生了一个氨基酸替换（NM_000525.3：c.80G>A，p.R27H）(图1b)。在空间结构中，R27H位于胞质区N末端，紧邻Kir6.2亚单位C末端ATP结合位点（R201和K185）（图2）。因为Arg携带正电荷，R27H可能会通过减少阳性电荷分布、增加2个相邻的ATP结合域单体间的空间排斥而减少Kir6.2配体结合的亲和力。

　　家系b的先证者在192号密码子发生了一个氨基酸替换（NM_000525.3：c.575G>A，p.R192H）（图1b），该突变位于Kir6.2的胞质区C末端。R192在2个相邻的Kir6.2亚单位间，位于对Kir6.2四聚体结构和成孔通道的稳定性具有至关重要作用的3个相互作用电子对中，是一个阳性电荷的提供者。

　　PSI-BLAST分析表明，Arg27或Arg192残基在哺乳动物的进化中高度保守，提示这两种氨基酸残基的重要性。我们提出的结构模型（图2）指出R27面向Kir6.2和SUR亚单位的交界处，提示与R192H相比，R27H可能对Kir6.2和SUR之间的相互作用影响更大。R27H和R192H突变均表现出比野生型Kir6.2更显著的IC50增高；且与R27H相比，体外R192H的ATP的敏感性降低7倍（图3a），提示R27H和R192H突变降低了这些突变通道对ATP诱导的KATP通道关闭的敏感性。

　　家系c的先证者携带一种杂合型框移突变，引起Ser116和Phe117的缺失（NM_000525.3：c.348-353delCTTCTC，p.S116F117del），引起框架内的2个氨基酸残基的删除（图1c）。由于体外未检测到功能缺失型S116F117del突变体KATP通道中的电流，我们未进一步检测其ATP敏感性及磺脲类药物敏感性。在我们提出的Kir6.2结构模型中，进化上高度保守的Ser116和Phe117氨基酸残基位于有成孔功能的H5结构域，而H5结构域位于跨膜区表面的KATP通道的出口处（图2）。Ser116位于连接跨膜区和孔螺旋H5的细胞外环（94-116）末端；F117位于成孔螺旋（117-128）的起始处。这些残基的缺失可能压缩了通道，阻止K+自由流出（见图2），这可能是体外可测电流的缺失以及胰岛素分泌失控的原因。因此，框架内删除的功能缺失性突变（p.S116F117del）可能是主要的高胰岛素血症（HI）突变。

　　携带突变的早发2型糖尿病家系的临床特征我们在先证者家系中检测到上述突变的存在。在家系a中的5例R27H携带者中，3人以前已被诊断为糖尿病。此外，检测当时一人被诊断为糖尿病，另一人则为IGT（图4和表1）；这些新诊断的突变携带者在诊断时的平均年龄为38.8岁（范围32～52岁），并接受胰岛素或格列齐特治疗；家族a中无肥胖者；所有的R27H携带者血清胰岛素水平都很低，而且2例使用胰岛素治疗的患者（II-1和II-2）没有检测到其血清中的C肽（表1），表明内源性胰岛素分泌减少。患者II-4和III-2则仅使用磺脲类药物（格列齐特）治疗，并达到了理想的血糖控制效果。此外，一例51岁的非携带者II-3患有IGT。该患者很可能是模拟表型，这是在MODY家系中已证实的一种现象。

　　R27H、R192H和野生型通道对于甲苯磺丁脲的敏感性无显著差异（P>0.05，图3b)，提示磺脲类药物能够有效关闭突变的通道并刺激胰岛素分泌。另外，既往研究显示，携带KCNJ11功能获得性突变的糖尿病患者能够成功地从胰岛素治疗转为口服磺脲类药物治疗。由于家系a中患病的R27H携带者（II-4或III-2）使用磺脲类药物能维持理想的代谢控制效果，我们将另两例R27H携带者（II-1和II-2）的治疗方法从胰岛素治疗转为口服格列齐特，而后患者的血糖均得到了良好的控制（HbA1c：5.7%～6.4%）。

　　在家系b中，有4例R192H携带者先前被诊断为糖尿病；在检测当时，其采用胰岛素或磺脲类药物（格列美脲）治疗（图4）。2例R192H携带者（II-1和III-1）使用胰岛素（加或不加二甲双胍）治疗，且其血清中C肽检测不到（表1），提示其存在内源性胰岛素分泌缺陷。另外两例使用磺脲（格列美脲）加或未加二甲双胍治疗的携带者（II-1和III-1）维持了良好的糖尿病控制，提示磺脲类药物对携带R192H的糖尿病患者是有效的。

　　在家系c中，两例S116F117del携带者之前被诊断为糖尿病（图4和表1）。在Kir6.2基因敲除小鼠分离出的胰岛中，高浓度葡萄糖或甲苯磺丁脲均未引起胰岛素分泌。在Kir6.2基因敲除小鼠中，甲苯磺丁脲可诱发胰岛素分泌缺失，提示磺脲类药物诱导的胰岛素分泌同样依赖于KATP通道的活性。在检测当时，S116F117del携带者II-1应用胰岛素后血糖得到了有效的控制。携带S116F117del的患者包括先证者III-1（女性、妊娠39周、出生体重4.0kg，位于正常上限95%～97%之间）、先证者父亲II-1（妊娠39周、出生体重3.8kg、位于75%～90%之间）以及先证者之子（妊娠38周、出生体重3.95kg、位于正常上限95%～97%之间）。但是，先证者未患病的同胞兄弟是非S116F117del携带者，出生体重位于正常范围（男性，妊娠40周，出生体重3.3kg，位于25%～50%正常范围之间）。另外，所有的S116F117del携带者均曾主诉儿童期有轻度的震颤、易饿、疲乏等症状，并可通过摄入食物或葡萄糖来缓解，先证者III-1、先证者之子及先证者父亲II-1当时测得的血糖分别为2.9～3.3mmol/L（52.2～59.4mg/dl）、3.4～3.7mmol/L（61.2～66.6mg/dl）和3.6～3.9mmol/L（64.8～70.2mg/dl），这可能在很大程度上归因于HI导致的轻度低血糖。

　　先证者III-1的临床过程描述如下：儿童时出现轻度的低血糖、成年早期发展为IGT、中年时发生糖尿病。自诊断以来，该患者一直接受磺脲类药物治疗，但没有达到良好的血糖控制效果（HbA1c：7.8%~9.2%）。将其治疗从磺脲类药物转为胰岛素后，血糖达到正常并维持在较为理想的水平（HbA1c：5.2%～6.3%）。患者的儿子IV-1在检测当时采取饮食控制IGT。

　　讨论

　　既往研究提示，90%～95%中国家族性早发2型糖尿病患者的遗传病因不明。本研究中，我们观察到96个中国早发2型糖尿病家系的KCNJ11突变频率为3.12%，提示KCNJ11可能是中国人群中尚未发现的一个单基因病因。尽管在本研究的中国先证者中我们发现了3个已知的KCNJ11变异，但其中任何一种变异均与家族性早发2型糖尿病无关。然而，E23K变异曾被报道与轻度的ATP敏感性下降及与2型糖尿病相关。

　　该研究显示，2种新的功能获得性突变（R27H和R192H）可通过降低Kir6.2的ATP结合活性而导致2型糖尿病的发生。最常见的突变为R201H，最轻度的常见变异为E23K，居中的突变为C42R与R192H或R27H，就其IC50而言，上述突变降低ATP敏感性的作用由大至小依次为R201H>R192H>C42R>R27H>E23K，这与其相应的糖尿病临床表型一致，即严重的表型为PNDM（永久性新生儿糖尿病），最轻微者为2型糖尿病，居中者为早发2型糖尿病或MODY。尽管这些数据提示KCNJ11突变存在一种强烈的基因型-表型相关关系，但这种相关是相对的，而不是绝对的。有研究报道，在一些携带C42R或R201H突变的家系中，临床表现和β细胞功能损伤程度不一致。即使携带同样R27H或R192H突变的家系，同一个家族的患者其临床症状也不完全相同。这提示，遗传和环境因素除影响患者对磺脲类药物的反应外，还影响患者的临床表型。

　　有研究指出，突变p.Glu227Lys（即E227K突变）位于E227，该位点具有调控R192-E227电子对之静电相互作用的功能。在体外突变杂合体E227K能降低KATP通道的ATP敏感性，并提高通道自身的开放概率。此外，既往数项研究报道，E227K突变可引起单基因型新生儿糖尿病。此外，E227K曾被确定为法国一个MODY家系的病因，因而在该研究中的KCNJ11基因曾被提议作为MODY13。这些E227K研究为“R192H以与E227K引起法国MODY家系患病的同样方式，导致了家系b的MODY基因突变阴性、呈常染色体显性遗传的早发2型糖尿病的发生”提供了支持。当然，需要进一步的研究以确定在生体上是否会发生上述效应。

　　我们推断，R27H和R192H携带者的2型糖尿病发病是由以下三种不同机制之一的葡萄糖诱导的胰岛素分泌缺陷所引起：①突变型KATP通道的ATP敏感性原发性缺陷，②R27H对KATP通道中Kir6.2和SUR1亚单位之间相互作用的影响，③突变体R192H对Kir6.2四聚体结构和成孔通道稳定性的影响。

　　人类SUR1/ABCC8或Kir6.2/KCNJ11功能缺失性突变是引起婴儿先天性高胰岛素血症最常见的原因。携带如杂合型ABCC8突变的KATP通道中功能缺失型突变的高胰岛素血症性低血糖患者，在以后的生活中将“逆转”为糖尿病。高脂喂养的小鼠模型显示，KATP通道功能缺陷可引起糖耐量异常和糖尿病。

　　家系c中3例患病的杂合型S116F117del携带者处于正常出生体重的上限，提示胎儿期可能发生了胰岛素过度分泌。另外，本研究中所有的患有糖尿病或IGT的S116F117del携带者在儿童期均有轻度低血糖症状。由于当时医疗条件较差，当地医院未进行胰岛素水平检测，我们推断其儿童期可能患有HI。因此S116F117del突变可能表现出一种新的常染色体显性遗传的轻度糖尿病亚型，其特点为儿童期出现高胰岛素血症性低血糖、成年早期出现IGT、中年期出现糖尿病，而这一特征性的临床表型的变化由缓慢的、进展性胰岛素分泌能力丧失所引起。有趣的是，一个之前报道的、影响S116位点的人类KCNJ11突变已被确定为HI的病因，这为家系c的p.S116F117del突变可能在儿童期引起HI提供了有力的支持证据。然而，胰岛素分泌能力进展性缺失和表型逆转的确切机制尚不清楚。

　　S116F117del携带者2型糖尿病的发生与葡萄糖引发的胰岛素分泌缺陷有关，这种作用可促进β细胞的凋亡，并能导致携带者在生命后期胰岛素分泌调节失控而引发高血糖。由于S116、F117和G132均定位于Kir6.2的成孔结构域，人类S116F117del突变携带者的临床过程可能与Kir6.2G132S转基因小鼠相似，后者在新生儿期显示出低血糖和胰岛素分泌失调，然后进展为因缺乏葡萄糖反应性胰岛素分泌而导致的严重高血糖。而Kir6.2G132S转基因小鼠在出现高血糖之前就发生了大量的β细胞凋亡，这提示KATP通道除影响胰岛素分泌外，还在β细胞的生存中发挥了重要作用。对于S116F117del突变携带者能否发生与Kir6.2G132S转基因小鼠相似的胰岛β细胞自发再生，这仍需要进一步探索与研究。未来进一步的S116F117del转基因小鼠实验有助于帮助我们解释该突变引起的HI或糖尿病之表型和机制。

　　该研究结果有助于改善患者的血糖控制。对R27H或R192H携带者停用胰岛素而改用磺脲类药物治疗，对S116F117del携带者持续使用或转为采用胰岛素治疗，均得到了良好的血糖控制效果。这提示，对常染色体显性遗传的早发2型糖尿病家系进行KCNJ11突变的基因诊断可能有助于理解MODY六个基因（HNF4α/MODY1、GCK/MODY2、HNF1α/MODY3、PDX1/MODY4、HNF1β/MODY5及NEUROD1/MODY6）患病率较低（10%～20%）的中国乃至亚洲人群中这类特殊类型糖尿病的分子病因学，并为之提供更加个体化的药物靶向治疗。

　　当然，我们仍需要进一步研究以确定这些KCNJ11的杂合型突变能否阻碍胰岛的发育或减少β细胞的数量。这些新突变的发现和确定拓宽了与KCNJ11突变致病相关的糖尿病表型谱，提示应将KCNJ11基因诊断纳入对常染色体显性遗传的、早发2型糖尿病的常规基因诊断程序。