T-705抑制剂：可成功治疗早期埃博拉病毒感染

埃博拉病毒出血热在撒哈拉以南非洲爆发，此病死亡率可达90%。目前，尚未有用于人体的疫苗或有效抗病毒治疗药物。本文，作者评估了吡嗪羰酰胺类T-705制剂在体内和体外对抗扎伊尔埃博拉病毒（EBOV）的效果。110μM的IC90合成后，T-705能以4个对数单位的强度抑制扎伊尔埃博拉病毒在细胞培养的复制。在体内感应试验中，作者使用了缺乏I型干扰素受体（IFNAR-/-）的小鼠。小鼠感染后第六天，将T-705输入体内，病毒数量明显减少，疾病严重程度的生化参数也有所降低，同时也防止了受感染动物100%的死亡率。研究结果表明T-705是治疗埃博拉出血热的方法之一。

线状病毒科埃博拉病毒由4种病毒类型组成，能导致人类出血热死亡率高达90%。据记载，扎伊尔埃博拉病毒于1976年在刚果民主共和国爆发（前扎伊尔），扎伊尔埃博拉疫情已在数个撒哈拉以南非洲国家爆发。而埃博拉出血热的主要特点为：免疫抑制、高病毒血症和感染性休克类的多器官衰竭。在灵长类动物身上的实验已证实某些疫苗的疗效，如：核酸疫苗、病毒载体疫苗和病毒样颗粒为基础的疫苗。但是，目前还没有疫苗获准用于人体。

另外，一些药物可用于感染初期的治疗，如：重组线虫抗凝蛋白-2（rNAPc2）、雌激素受体调节剂、siRNA、干扰素或单克隆抗体中和活性。但这些药物都对窗口期在两日以上的感染无疗效。针对扎伊尔埃博拉病毒糖蛋白的水泡性口炎病毒为载体的疫苗也显示其在感染后期的相似作用。最近研究发现，如果病毒血症和症状在早期就被发现，那么把单克隆抗体与胰腺病毒载体上的α干扰素相结合，便能将疗效延长至窗口期3日后病毒感染。虽然医学上已有重要发现，然而就目前对有症状的流行性出血热疾病的临床管理的迫切需求而言，扎伊尔埃博拉病毒的治疗窗仍然太窄。

2002年，日本的富山化学工业公司发明了吡嗪羰酰胺类T-705制剂，该制剂用于抑制流感病毒的复制；目前，正处于研究其用于流感治疗的临床后期。吡嗪羰酰胺类T-705制剂由宿主酶转换为三磷酸盐，作为核苷类药物有选择性地抑制病毒性核糖核酸聚合酶。但是，吡嗪羰酰胺类T-705制剂与病毒核酸结合后，可导致致命的突发诱变。除了流感病毒，T-705对其他体内和体外片段负链RNA病毒都有有效的抗病毒活性，如沙粒病毒、布亚病毒。

我们参照以上这些报告，研究中主要针对T-705对属于单链负链RNA病毒的埃博拉病毒的效果。T-705化合物（药物名称法匹拉韦，CAS号259793-96-9；有机小分子生物活性数据CID值492405）是委托美国创意动力公司BOC科技合成。它可溶解于浓度为10mg/ml的二甲亚砜（DMSO），存储温度为20℃。所有试验所用的病毒类型为野生型扎伊尔埃博拉病毒Mayinga1976株，并在位于德国汉堡的BernhardNocht热带医学研究所的P4实验室进行。大约1980年，佐治亚州亚特兰大市疾控中心提供了该病毒。自1976年起，代次无记载，所以为了精确定义我们的菌株，菌株均全部编排序列号。菌株序列与扎伊尔埃博拉病毒Mayinga1976株完全一致（基因库序号NC_002549），C1751T将核蛋白密码子由CCC(Pro)转变为TCC(Ser)，G6175A将糖蛋白密码子由AGT(Ser)变为AAT(Asn)。病毒是在VeroE6细胞（ATCC序号，CRL-1586）中进行培养，由免疫聚集法定量（见下文），在-70℃下贮存，直到被用来进行体外及体内试验。

首先，我们对T-705在细胞培养时的抗病毒活性进行评估。该化合物1小时前，加入感染倍数为0.01的埃博拉病毒的VeroE6细胞。细胞培养上清液中的二甲亚砜最终浓度为0.1%。感染五日后，细胞培养上清液中传染性埃博拉粒子的浓度由猴抗埃博拉病毒多克隆（由皮埃尔·罗林友情提供）免疫实验法确定。细胞活性是由如上所述的溴化噻唑蓝四氮唑法决定的。T-705能够抑制4㏒单位埃博拉病毒的复制，其抑菌浓度将病毒滴度减少了50%，它与目前唯一受测试的单股反链病毒目IC50属于同一数量级，该病菌的名称为呼吸道合胞体病毒（RSV，IC50=41lg/ml）。在MTT实验范围内，T-705内并不影响细胞活性（细胞毒性浓度将细胞生长减少了50%1000μM）。

然后，我们将T-705疗效应用于动物模型。为了达到这个目的，我们使用缺少IFN-alpha/β受体(IFNAR/)的小鼠，因为它们容易受到野生型扎伊尔埃博拉病毒Mayinga1976株的影响。为了排除与小鼠基因有关的影响，同时使用了IFNAR-/-C57BL/6和IFNAR-/-129/Sv两种小鼠。所有动物试验都是严格遵循德国实验室动物科学学会规范并在兽医的监督下，在安全级别为4级的实验室内进行。该协议经汉堡动物试验伦理委员会的同意。所有参与该项动物试验的人员均通过了欧洲联盟实验室动物科学协会B或C类教育和培训。试验组包括5到10只年龄相当的母鼠。对埃博拉病毒的自然黏膜暴露由稀释在50ll磷酸盐缓冲盐水中的1000病灶形成单位通过鼻腔接种形成。T-705通过使用胃探针每天两次在0.5%的甲基纤维素中执行。

IFNAR-/-C57BL/6小鼠接受了以300mg/(kg×d)剂量的治疗6天或更久。正如我们期待的一样，未接受治疗的埃博拉病毒感染小鼠在感染十日后100%死亡。所有小鼠体重均迅速下降，有些达到了我们的动物协议中签署的临终极限（最高20%的下降率）。在未接受治疗的小鼠中，血清氨基转移酶和丙氨酸转氨酶（AST和ALT）的升高水平达到了流行性出血热的标准——病毒血症高达6㏒FFU/ml，体温持续降到32℃以下，符合休克的症状。接受治疗的第一天，T-705组小鼠的体重下降程度和对照组相似，发展成病毒血症，AST和ALT血清水平升高，出现了埃博拉病毒的感染迹象。开始治疗两天后，接受治疗小鼠的AST和ALT水平和病毒血症与对照组相比急速下降。接受治疗后的四天，受试小鼠的血液中已经没有了病毒的迹象。治疗时间持续了13天，在三周的观察期末，所有小鼠痊愈（100%治愈率，对照组死亡率100%）。

所有通过了免疫荧光试验的治愈的小鼠获得了埃博拉病毒抗体及病毒核蛋白质CD8T细胞，这表明T-705对病毒的抑制作用使得受体即使在缺乏IIFN信令指标的情况下也能增加病毒特异性免疫应答。

为了确定T-705的治疗窗，第八天以300mg/(kg×d)的用量对一组小白鼠进行了给药。这次实验的结果显示，AST、ALT和病毒血症均达到了峰值，体温下降。体重的降低就是证据，与人类的临终界限接近。T-705治疗延迟了死亡时间，降低了即使是在临终状态的小鼠中的1/5病毒负荷和生化疾病，但是未能阻止死亡。因此，在IFNAR-/-C57BL/6小鼠模型中，T-705对扎伊尔埃博拉病毒感染6日内的高病毒血症和明显的疾病迹象是有治疗效果的，但对处于发病晚期的症状几乎没有疗效。

IFNAR-/-129/Sv小鼠接受的药物治疗方案为：第2至第9天给药30mg/(kg×d)；或第2至9天、第4至11天或第6至13天的时候给药300mg/(kg×d)。奇怪的是，除了显而易见的疾病临床指标和生化指标之外，接近80%未接受治疗的小鼠收到了感染但未死亡。这与前面雾化Zaire1976EBOV对IFNAR-/-129/Sv小鼠致命的结果恰好相反。这样截然相反的结果可能是因实验所使用的菌株不同而引起的（实验使用的菌种为ZaireEBOVE7181976和Mayinga)。此外，Lever等的研究使用碰撞喷雾器，产生的颗粒直径集中在1-3μm，这样大小的颗粒易在呼吸道沉积，而不易在鼻腔内定植。从图3可以看出，对照组小鼠第8天时的血清AST水平为352-9500U/I，ALT水平为210-2400U/I，相反，所有使用T-705的小鼠，其血清AST和ALT水平都显着降低（p值分别为p=0.0016-0.0031和p=0.001-0.002；使用Mann-WhitneyU检测）。另外，8天后对照组小鼠血清平均病毒生物量为5.1×105FFU/ml，而经T-705治疗的实验组小鼠血清中没有检测到病毒，而与初始给药剂量和用药时间无关（p=0.02-0.0055；使用Mann-WhitneyU检测）。八天后，所有实验组小鼠的生存率、体重减轻以及体温都没有显着的统计学差异。与C57BL/6小鼠相似，所有存活下来的129/Sv小鼠的EBOV特异性抗体和CD8T细胞都有所增加（数据未列出）。

据我们所知，T-705是第一种经动物模型证实，针对扎伊尔埃博拉病毒早期感染有效的治疗药物。动物实验结果表明，在受感染6天内使用该药物可减轻病毒血症、改善病症的临床和生物学症状，避免死亡。用药时间相当于对照实验动物死亡的前2-4天。我们的研究与对接受埃博拉病毒喷雾处理后1小时的小鼠使用T-705可避免IFNAR-/-129/Sv小鼠死亡的新闻报道相一致且有所延伸。T-705的另一优势是能够通过口服途径减轻EBOV病毒血症。这与利巴韦林相当，其可口服治疗其它出血性发烧如拉沙热，但对丝状病毒无效。数据进一步表明，T-705是活跃在体内对抗组成许多人病原体的具有单股反链病毒目顺序的病毒。前面的例子证明，T-705在体外对抗副粘病毒呼吸道合胞病毒比分割负链RNA病毒更难，这在一定程度降低了假定使用T-705于非节段负链RNA病毒的乐观性。对于EBOV，T-705的IC50比对流感病毒或沙粒病毒更高。不过，该药显示的体内效果明显，T-705有希望对其他病毒等有抑制作用，在体外只有在相当高的药物浓度才能达到体内的疗效。在EBOV感染的情况下，我们推测T-705在体内抑制病毒复制，使宿主免疫系统的自适应臂有效地对付病毒感染，从而有助于T-705的治疗效果。这与之前的数据所显示的结果EBOV血症水平与宿主的免疫应答的强度之间的关联一致。更多可以确定在T-705治疗中免疫反应参与的试验正在进行。在各种小动物模型中，T-705已经被证明有效抑制RNA病毒复制。这些发现和数据使得我们的研究结果转变为更现实的流行性出血热模型更为谨慎乐观，如除人类之外的其他灵长类动物，并最终临床实践。