黑色素瘤的分子病理诊断和个体化治疗进展

根据美国国立癌症中心的统计数据，在2014年的新发恶性肿瘤中，黑色素瘤约占4.6%，美国目前有黑色素瘤患者921,780名，每年死亡人数超过9,000名1。最近几十年间，黑色素瘤的患病率和死亡率均有明显的增加。由于黑色素瘤的组织学形态多种多样，遇到疑难病例，即使是有经验的病理医生也难以仅凭组织学形态做出明确诊断。随着分子病理的飞速发展，分子诊断在黑色素细胞病变的诊断和治疗过程中扮演着越来越重要的角色，除了协助诊断，还能明确基因突变的位点，了解黑色素瘤的特异性遗传学改变，为黑色素瘤患者的个体化治疗提供有价值的的信息2,3。本文总结了黑色素瘤中的特征性基因突变、分子检测方法及最新的个体化治疗进展，同时重点阐述了BRAF和KIT基因突变及FISH检测在黑色素瘤诊治中的作用。 　　1、黑色素瘤中的关键分子通路 　　1.1BRAF 　　BRAF是丝氨酸/苏氨酸激酶，在神经组织、黑色素细胞以及睾丸和造血组织的细胞中均可见BRAF的高表达，通过形成异源或同源二聚体活化，参与细胞增殖。一般情况下，该酶的活性由RAS增强，通过ERK（细胞外信号调节激酶）负反馈抑制1,4,5。随后，BRAF磷酸化激活MEK（丝裂原活化蛋白激酶），MEK作为BRAF的唯一底物，可激活细胞的有丝分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase,MAPK）信号传导通路，促进细胞增殖(图1)。 　　图1.MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）和AKT（蛋白激酶B）信号通路是黑色素瘤中调控细胞增殖和细胞存活的最主要的两个通路。一般情况下，MAPK信号通路调控细胞增殖，而AKT通路抑制细胞凋亡并促进细胞存活。BRAF的二聚化和激活由NRAS介导。BRAFV600E的突变导致激酶组成性激活，从而增加细胞增殖。ERK（细胞外信号调节激酶）发挥负反馈作用。 　　BRAF突变是黑色素瘤中最常见的突变，约见于50%的病例，其中80-90%的BRAF突变位于第600位编码子，原有缬氨酸被谷氨酸取代，通常标记为BRAFV600E，这一替换导致MARK/ERK通路激活，从而促进细胞增殖1-4,6。第二种最常见的突变形式是BRAFV600K（赖氨酸取代缬氨酸），在黑色素瘤BRAF基因突变中约占10%1,5,7。其他的BRAF基因突变所占比例很小（＜1%），因此，病理分子检测中主要针对BRAFV600E和V600K。 　　许多良性色素痣中同样可检测到BRAF突变，报道称，后天获得性痣可达79%，结节性痣可达50%，这些伴BRAF突变的痣绝大多数和慢性日光性皮损无关。在日光皮损相关性痣，如粘膜及肢端的色素痣中极少见到BRAF突变7。有人推测BRAF突变和色素痣形成的始动环节有关，可促进痣的生长，也有报道称BRAF与P16同时突变可引起黑色素细胞的恶性转化。 　　目前发现年龄是BRAF突变的黑色素瘤的高危因素之一，小于55岁的患者BRAF的检出率更高，有报道显示BRAF突变的黑色素瘤与年龄呈负相关8。很多研究发现黑色素瘤的BRAF突变与多种组织学表现相关，BRAF突变的黑色素细胞更大更圆，色素更多，更容易成巢和向上扩散。而且，与无突变黑色素瘤相比，BRAF突变的黑色素瘤与周围未受累的皮肤组织分界更清晰，病变处表皮的增厚更明显，但肿瘤本身的厚度和表皮是否有溃疡形成与BRAF突变并无相关性8。研究对比BRAFV600E型突变和其他突变的临床特点时，发现大部分非V600E型的黑色素瘤与慢性日光性皮损相关，且患者年龄偏大，例如，V600K突变的黑色素瘤多同时伴有日光性弹力组织变性。这提示与常见的V600E型突变不同，V600K的突变可能与慢性辐射损伤有关7。 　　近期的研究发现与野生型黑色素瘤比较，BRAF突变型总体治疗效果及预后较差，但以往的研究并未发现其对无远处转移生存或无病生存的影响8-10。比较不同类型的BRAF突变发现，与V600E黑色素瘤相比，V600K突变的黑色素瘤首次转移前的无病间期较短，但总体生存率上并无差别。由于V600K的患病率低，所以针对该突变对黑色素瘤预后影响的研究还很有限7。如前所述，非V600E突变与慢性晒伤关系密切，可能涉及慢性辐射损伤相关的BRAF突变机制。因此，很有必要进行深入研究，以揭示不同类型突变对病人预后的影响。 　　1.2KIT 　　KIT是一种跨膜糖蛋白，分布于细胞表面，属于III型酪氨酸激酶家族，配体为干细胞因子（stemcellfactor，SCF）。KIT在正常的黑色素细胞周期中扮演非常重要的角色，通过与相应的配体SCF结合形成二聚体，激活酪氨酸激酶，通过自身磷酸化进一步磷酸化激活下游各种效应子，完成多种信号的传递，包括MAPK通路及Akt/PI3K通路等，最终活化胞浆内的转录因子，从而调控基因表达、细胞生长和增殖。 　　KIT基因异常包括突变和扩增，两者既可单独存在，也可同时出现11。虽然KIT突变仅占所有黑色素瘤的3%，但在慢性日光皮损相关的黑色素瘤、肢端及黏膜等特定部位的黑色素瘤中，KIT突变的发生率可达23%11,12。尽管这些病例中已知如BRAF或NRAS基因突变，KIT检测仍然非常必要，因为结果有助于预测黑色素瘤的进展、远期转移和生存期。在黑色素瘤中最常见的KIT突变位点为外显子11的L576P和外显子13的K642E，但KIT基因突变具有明显的异质性，黑色素瘤中的KIT突变分布于第9、11、13、17和18号外显子中，因此KIT突变检测时需要检查所有这些外显子的序列11,13。 　　2、黑色素瘤其它分子通路 　　2.1NRAS 　　NRAS突变与先天性色素痣相关性最强，尤其是那些直径较大的痣（>37.5px），研究发现在大约55%的先天性色素痣中可检测到NRAS突变1。最常见的突变形式是第3外显子的氨基酸置换，包括Q61K和Q61R，约占NRAS突变的65%。检测NRAS突变的意义在于NRAS优先激活CRAF而不是BRAF，这可以解释为什么有些色素痣不发生BRAF突变，可能通过NRAS激活CRAF途径导致黑色素细胞的增生，因此，临床也尝试通过CRAF抑制剂诱导黑色素瘤细胞的凋亡。最近的一项二期临床研究显示，MEK1/2抑制剂对大约20%的黑色素瘤患者部分有效14。 　　2.2HRAS 　　目前研究发现在黑色素细胞病变中，HRAS突变多见于Spitz痣中，之前研究发现大多数伴有11p获得的Spitz痣与HRAS突变相关，而后者被发现位于11号染色体的短臂。HRAS突变与先天性痣、后天获得性痣或发育不良型痣的关系尚未见报道15。 　　3、染色体异常 　　3.1荧光原位杂交技术在诊断黑色素细胞病变的临床应用 　　荧光原位杂交(Fluorescenceinsituhybridization,FISH)技术在疑难黑色素细胞病变的诊断中发挥越来越重要的作用，借助FISH检测可明确鉴别病变的良恶性质2,3。多数情况下，FISH检测用于福尔马林固定的石蜡标本，利用核酸分子碱基配对互补原则，荧光标记的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补结合形成专一的核酸杂交分子，检测待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置和数量。应用不同光谱的激发荧光即可观测标记物的扩增或缺失。除了单一激发荧光外，还可以将不同的荧光进行叠加从而得到更多的标记颜色，进行相对定量分析15。目前，多探针FISH检测是辨别黑色素细胞病变良恶性相对客观可靠的方法。临床上最常用的FISH筛查试剂盒采用6号染色体上三个基因靶点6p25/RREB1、6q23/MYB和6号染色体着丝粒，以及11号染色体11q13（CCND1）靶点的组合，应用这个组合试剂盒进行黑色素瘤鉴别诊断的敏感性达87%，特异性达95.4%16。 　　FISH检测的问题在于结果的解读。例如由于切面的缘故而导致计数错误，因此FISH结果计数时一定要保证足够数量的肿瘤细胞15。如果送检的肿物非常小，没有足够可计数的细胞核，这时FISH的诊断就会非常困难。有时肿瘤细胞密集，细胞核相互重叠也会造成计数错误。此外，有的研究应用29%的细胞阳性作为判定点，而有的研究应用38%的细胞阳性作为判定点，不同的判定标准必然导致不同的研究结果1。 　　尽管如此，FISH检测仍旧是现阶段鉴别黑色素细胞病变良恶性的重要辅助手段。有研究报道FISH的阳性预测值大约为62.5%，阴性预测值为80.7%1，这就提示我们应用FISH鉴别黑色素细胞病变的良恶性时一定要结合组织学形态。该作者认为阴性的FISH结果相对比较可靠，而遇到和形态学相左的阳性结果时，一定要谨慎对待，不能一味依赖FISH结果做诊断。最近的报道发现，黑色素瘤存在遗传异质性及与克隆无关的转移病灶，这意味着在转移性黑色素瘤的克隆进化中，遗传性分化并不少见。在鉴别模棱两可的黑色素细胞病变时，组织学形态相比FISH有更高的敏感性（95%vs43%），但特异性差（52%vs80%），但二者结合时敏感性和特异性均明显升高（分别达76%和90%）。因此，鉴别黑色素细胞病变良恶性时，FISH只作为辅助手段，一定要结合组织学形态1。 　　3.2染色体片段的增加或缺失 　　多项黑色素瘤研究通过FISH检测发现多种染色体的获得或缺失，而这些染色体异常并不出现在良性痣中。常见的染色体异常位于6p、1q、6q及9p。分子病理检测相关的染色体异常对明确黑色素瘤的诊断和了解预后具有非常重要的意义。 　　6p的增加见于30%的黑色素瘤，常提示预后较差，而且与组织学形态上较厚的肿瘤相关，在薄层型的黑色素瘤中没有查到6p的异常。1q的增加见于约25%的黑色素瘤，也提示预后较差，但多见于薄层型的黑色素瘤。 　　6q的缺失见于28%的黑色素瘤，临床主要用于鉴别良性Spitz痣。10号染色体缺失见于63%的黑色素瘤，由于良性Spitz痣同样没有这种染色体异常，故而也用于鉴别形态类似黑色素瘤及Spitz痣。 　　应用6p25（RREB1）的增多检测黑色素瘤具有较高的敏感性（约73%），相比单独用6号着丝粒（CEP6）的检测敏感性大大增高，6q23（MYB）和CEP6联合使用，6q23的缺失在黑色素瘤中的检出率大约24%。，MYB常常和RREB1联合用于检测黑色素细胞病变的良恶性1。 　　3号染色体单体的异常见于50%的葡萄膜黑色素瘤，具有该染色体异常的患者转移几率大大提高，相对无该染色体异常的患者，疾病相关的死亡率也自13%提高到75%，故而在葡萄膜黑色素瘤中检测该染色体异常非常重要。与此同时，有研究表明如果3号异常同时伴有8号染色体的丢失，则肿瘤转移的几率增加1。 　　9p的丢失和遗传性黑色素瘤综合征相关，有研究发现9p21的丢失多见于细胞增殖型的黑色素瘤，该染色体异常多提示较好的预后。9p的丢失大约见于80%的黑色素瘤，由于类似的染色体异常在发育不良的痣中也有报道，所以这种丢失或许是黑色素细胞病变发展的早期基因学改变2,3。 　　4、分子检测和靶向治疗 　　4.1BRAF的检测和靶向治疗 　　BRAF基因突变通过传统的Sanger测序法检测，这种检测方法将不同颜色荧光标记的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）混入含有普通脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)的反应池。ddNTPs因缺少3’端羟基而阻断DNA复制，单个ddNTP结合到DNA合成片段末端即能终止复制。得到的不同长度DNA片段因迁移速度及荧光标记不同，通过凝胶电泳可推测出DNA的碱基序列。最近的一项研究显示罗氏公司的COBAS4800可能是一种较灵敏的检测方法。该方法能检测到不同的BRAF基因突变（V600E和V600K），但即便是这种先进的方法，也只能检测50%的V600K基因突变，如果V600基因突变发生频率过低的话也无法被检测。报道称这种检测方法的分析失败率低，而可重复性高。在这项检测方法中，目的基因得到扩增并结合荧光标记探针，而只有在探针与目的基因结合时下才会发出荧光，分离时则荧光信号丢失。检测荧光反应量并将之绘制成与温度对照的曲线，将荧光信号丢失二分之一时相对应的温度定义为解链温度（Tm）。通过图表分析解链温度曲线即能够准确检测突变的DNA2,3。 　　采用免疫组化染色检测BRAFV600E也是一个不错的选择，有研究显示其敏感性为97.3%，特异性为100%。免疫组化检测所有的V600突变时，敏感性下降至91%，对该抗体结果的标准化解释或许会给抗体的应用带来广阔的前景17,18。 　　现阶段临床推荐所有晚期黑色素瘤（不能手术切除的III期和IV期）患者进行BRAFV600突变检测，以便指导BRAF抑制剂的合理使用5。 　　最近，两种BRAF抑制剂，vemurafenib(维罗菲尼)和dabrafenib(达拉菲尼),在治疗BRAFV600E突变的黑色素瘤都显示出50-60%的反应率(RRs)，同时使患者获得更长的无进展生存期19-21。这两者都是ATP的竞争剂，选择性抑制BRAF，相对野生型BFAF，它们与突变的BRAF亲合力更强。最初，两种抑制剂的临床试验仅选择V600E突变的患者；然而，新的证据表明其他发生率较低的BRAF突变的患者同样能从治疗中受益。最近dabrafenib和一些vemurafenib的研究也开始在评估这些药物对非V600E突变患者的疗效12,19,22，结果不出意料，没有证据表明BRAF抑制剂对BRAF非突变患者有效。但值得注意的是，BRAF野生型的黑色素细胞经过BRAF抑制剂处理后仍处于持续激活的状态，因此，将黑色素瘤的BRAF突变进行分类非常必要。这种反常激活也见于约四分之一接受BRAF抑制剂治疗后发生鳞状细胞癌和角化棘皮瘤的患者，因此有人提出，BRAF抑制剂作用于RAS突变的角质细胞，可促进细胞增殖23；在小鼠模型中，在RAS突变和BRAF抑制剂同时存在的情况下，细胞系中MAPK途径被反常激活，非黑色素瘤的皮肤癌会加速生长。而在相同情况下，加入MEK抑制剂可显著抑制这些肿瘤的发生发展1,4,5。 　　使用BRAF抑制剂的一项I期临床试验选择了32名V600E突变的患者，其中81%的患者显示完全或部分的反应率。另一个涉及132名治疗后的V600突变患者的II期临床试验中，53%的患者证实有确定的治疗效果，6%病人的肿瘤症状完全缓解，仅14%的患者出现疾病进展，中位生存期为15.9个月。在针对675名V600E患者的III期临床试验中，比较vemurafenib和dacarbazine，经Vemurafenib治疗的患者肿瘤体积明显减小，vemurafenib治疗患者的有效率为48%，而dacarbazine治疗的有效率仅为5%。经过vemurafenib治疗患者的死亡风险相对降低63%1,4,5,19,20,24，接受BRAF抑制剂治疗后，随着肿瘤的缩小，肿瘤内浸润的CD4+和CD8+的淋巴细胞显著增加25。此外，BRAF抑制剂并未对免疫反应产生不利影响，这有利于对抑制剂和免疫制剂联合使用进行研究26。迄今为止，dabrafenib的临床试验数据是非常有效的。在晚期黑色素瘤患者中，dabrafenib被证明比dacarbazine（达卡巴嗪）更加有效（改善无进展生存率和总体治疗有效率），并且对颅内病变的患者也有效21。 　　4.2KIT的检测和靶向治疗 　　由于KIT筛查需检测所有的外显子，做一个检测费时费力，所以为了提高效率和资源合理配比，只有BRAF阴性的肢端或者黏膜黑色素瘤患者才推荐进行KIT的全外显子筛查。如果将来找到对应特定治疗的KIT检测靶点或许能够降低KIT检测的花费和难度1,4。 　　关于KIT突变的相关治疗，已明确证实KIT抑制剂甲磺酸伊马替尼可有效治疗胃肠道间质瘤和白血病。最新的NCCN治疗指南中将伊马替尼（imatinib）作为KIT突变的转移性黑色素瘤的指导用药27。 　　有研究显示甲磺酸伊马替尼只对KIT外显子11或13突变有效，所有治疗有效的患者包含L576P或K624E的突变，而前者位于11号外显子，后者位于13号1,4,11,12。正确识别这些致瘤突变，寻找意义更明确的检测点，或许会帮助我们找到更特异的KIT抑制剂。 　　除了KIT突变，多项试验都证实单纯的KIT扩增应用KIT抑制剂无效。 　　4.3NRAS 　　在应用NRAS抑制剂的治疗中，针对NRAS的小干扰RNA（siRNA）可抑制黑色素瘤细胞系的增殖，同时提高肿瘤细胞对化疗的敏感性。研究显示，脂肪酸转移酵素抑制剂(FTIs)可通过阻断RAS翻译后修饰的关键酰化步骤而抑制RAS的激活。Tipifarnib（替吡法尼）作为FITs的一员，在治疗转移性黑色素瘤的一组单药、单边II期临床试验中28，由于最先入组的14名患者的无效结果导致试验提前终止。目前尚缺乏RAS特异的抑制剂，针对RAS通路中伴随因子的抑制剂的研究或许能够解决问题。 　　5、靶向治疗的耐药性和抑制剂的联合治疗 　　5.1抑制剂治疗的耐药性 　　BRAF抑制剂治疗黑色素瘤的有效性已经公认，但肿瘤完全缓解的例数很少1,4。通过研究黑色素瘤细胞对抑制剂的逃避，研究者发现了许多BRAF抑制剂的耐药机制。 　　有些黑色素瘤的耐药性是通过重新激活MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）途径，研究中发现抑制剂治疗后的黑色素瘤出现NRAS、CRAF和MEK的突变和/或过表达29。而通过研究BRAF突变的黑色素瘤细胞系，发现抑制剂处理后，细胞系通过ERK激活介导的耐药性的产生并不依赖于BRAF的活性。只有在通路中的三种RAS亚型均被抑制的时候，ERK的激活才能被成功抑制，提示这些肿瘤细胞能够在不同的RAS亚型间进行内部转换从而保持持续的异常增殖。在相同细胞系的研究中还发现，抑制MEK是阻止细胞增殖的有效途径30。另一个明确的耐药机制与COT的表达有关，COT蛋白也通过ERK的活化重新激活MAPK途径从而引起细胞增殖31。此外，黑色素瘤还可通过激活AKT途径逃避抑制，在文献中描述了两种机制：第一种是PDGFRβ（血小板源性生长因子受体β）的上调，第二种是IGF-1R（胰岛素样生长因子1受体）的表达增加32。这两种跨膜蛋白通过激活PI3K（磷脂酰肌醇-3激酶）从而激活AKT途径引起抑制剂治疗耐药。 　　虽然使用BRAF抑制剂治疗时疾病进展后并未检测到新的BRAF突变30,32，但最近的研究发现了一种新的耐药机制，BRAF的剪接变异体p61BRAF(V600E)在伴低水平活化的RAS时或经过维罗菲尼处理后，均会出现二聚体增强33。 　　有关KIT抑制剂治疗黑色素瘤的耐药机制研究非常有限，GIST治疗的耐药机制则相对较多，但大多数试验中并未将患者按KIT外显子突变类型进行分类，正如文章前面所述，现阶段KIT抑制剂治疗非11、13外显子突变和仅有KIT扩增的黑色素瘤是无效的。5.2抑制剂的联合治疗 　　现阶段的研究已经发现黑色素瘤有多种方式对抗抑制剂的治疗，随着时间的推移，我们将会发现更多的耐药机制，随着靶向治疗的蓬勃发展，准确检测特定类型的分子异常，明确判断肿瘤的耐药机制越来越重要。与此同时，正如大多数恶性肿瘤的治疗方案涉及多种方法联合一样，黑色素瘤的治疗也不例外。 　　采用MAPK和ATK通路的抑制剂联合治疗黑色素瘤仍处于研究阶段，目前的结果好坏均有。在联合治疗中，有报道发现了针对BRAF和MEK联合抑制的交叉耐药，今后还有可能出现更多交叉耐药34。临床应用中发现采用BRAF抑制剂加上MEK抑制剂或mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)抑制剂的联合疗法能克服黑色素瘤细胞系对BRAF抑制剂的耐药性。曲美替尼是一种MEK的抑制剂，和V600E/K突变患者的常规化疗相比，联合使用可以延长无进展生存期和患者的总生存期35，而且对BRAFL597S突变患者也有效36。转移性黑色素瘤患者经过BRAF和MEK抑制剂联合治疗，相对单一药物治疗，患者的无进展生存期明显延长37。 　　在联合治疗中很重要的一类是抑制剂和免疫治疗药物联合，在最近的研究中，有证据表明应用伊匹单抗（ipilimumab）可有效治疗KIT突变的黏膜黑色素瘤，而且没有研究显示KIT突变的黑色素瘤对免疫治疗无效。研究者建议当黑色素瘤患者的一般情况良好时首先应用免疫治疗，在免疫治疗基础上合并KIT抑制剂，或许会带来更好的临床疗效11。 　　综上所述，虽然黑色素瘤尤其是临床晚期的黑色素瘤仍是恶性程度最高的肿瘤之一，分子病理检测和基因靶点治疗药物的蓬勃发展使我们在攻克这一顽疾的道路上取得了很多实质性的进展。BRAF和KIT突变的靶向药物的使用为很多患者带来了可预期的临床疗效，但是越来越多的的研究也揭示了不同的黑色素瘤的逃逸机制和目前检测手段中的不足。结合临床资料，应用合理的检测，明确分子亚型，筛选靶向治疗人群均是黑色素瘤个体化治疗的关键。