自噬与骨肉瘤的研究进展

　　自噬作为一种细胞防御和应激调控的机制，是目前癌症研究领域的热点。自噬异常与恶性肿瘤的能量代谢、细胞死亡、炎性反应以及对肿瘤化疗的耐药性等方面都有密切的联系。骨肉瘤（OS）的总生存率在过去的20年里一直没有新的突破。手术联合化疗仍然是治疗骨肉瘤最有效的手段。目前已有研究证实自噬与骨肉瘤化疗明显相关。因此本文就自噬与骨肉瘤的研究进展作一综述。

　　原发性骨肉瘤（OS）是非常罕见的恶性肿瘤之一，却是最多发的原发性骨肿瘤，每百万人中约10例患者被诊断，尤其在儿童年龄组中约2~5例患者被诊断为OS。由于这种肿瘤有较高的转移倾向，因此它是肿瘤死亡的最常见的原因之一，尽管这种肿瘤只占儿童肿瘤的5%~6%。随着20世纪70年代新辅助化疗的引进，OS的5年生存率从20%提高到65%~70%。然而，在过去的二十年中，在生存率方面并没有任何进一步提高，几乎1/4的患者在发生转移后才被确诊。大约一半的患者最终死于该疾病的肺转移。而自噬异常与肿瘤密切相关，因此，本综述旨在探讨自噬在骨肉瘤发生及化疗中的作用，以期进一步揭示骨肉瘤发生、发展的潜在机制。

　　1自噬

　　Autophagy是希腊术语中“自我吞噬”之意，是指蛋白质转换过程中起管家作用的物质允许细胞消除不需要的蛋白质或已损坏的细胞器。在饥饿、低氧及细胞毒性作用等压力性环境下，细胞自噬作为能量来源，为机体提供氨基酸来维持细胞生存，它对细胞存活、代谢及生长等不同生物学功能发挥了关键作用。还有研究显示细胞自噬与一系列生理及病理生理行为相关，如老化、肌肉疾病、神经退行性疾病及癌症等。虽然人们多认为自噬是在不利环境下机体提高细胞存活时间的一种保护性机制，但近期研究显示细胞过度自噬会导致细胞死亡。在现阶段通常将程序性细胞死亡（PCD）分为三型，Ⅰ型PCD为凋亡，Ⅱ型为程序性细胞死亡即自噬，Ⅲ型为程序性细胞坏死。随着细胞死亡相关研究的深入，Degtere在2005年首次提出了坏死性凋亡的概念。坏死性凋亡是一种不依赖于caspase和Bcl-2，也不出现线粒体的细胞色素C释放外的新型细胞死亡途径。起初人们认为不同死亡方式之间潜在的细胞调节程序截然不同，然而近来的研究显示细胞死亡的潜在机制非常复杂，在一定情况下,多种死亡方式之间相互联系甚至相互转化，其中关键的调节机制涉及到线粒体渗透性转变（mitochondrialpermeabilitytransition,MPT）和能量。自噬可独立拮抗或延迟细胞凋亡，这些过程在肿瘤形成过程中的相互作用尚未明确，但取决于肿瘤类型、环境以及疾病分期。细胞自噬分为3类：分子伴侣介导的自噬、微自噬、巨自噬。它们的基质向溶酶体转运过程各不相同。本文重点关注巨自噬-即经典的自噬，这也是目前的研究热点。

　　自噬过程分为多个阶段，包括诱导、自噬体核形成、伸长、完成、溶酶体溶解、降解以及再循环。这些阶段由超过30种自噬相关（Atg）基因调节。当出现营养不良、缺氧和（或）接受化疗时，Atg1复合体激活，导致平板膜池、吞噬泡形成，或通过激活Vps34构成的复合体导致隔离膜及囊泡核形成，其中Vps34由磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）和自噬蛋白苄氯素1共同构成。Vps34构成的复合体还参与囊泡运输过程。这些复合体相互作用及其他因子共同协助为自噬小体的形成提供所需蛋白及脂质。经过伸长后，自噬小体形成。自噬小体伸长过程是由2个类泛素系统介导的。第1个系统参与了由类E1酶及Atg7介导的Atg12、Atg5及Atg16复合体的形成。第2个系统调节微管相关蛋白1轻链3（LC3-I/Atg8）与磷脂酰乙醇胺（PE）的结合。LC3首先被合成为未加工形式，即前体LC3，随后经蛋白水解为LC3-Ⅰ。LC3-Ⅰ经蛋白酶Atg4裂解为PE共轭形式LC3-Ⅱ，并由细胞质转运至自噬体膜内。LC3是目前所知唯一的自噬体标志物。在该阶段，溶酶体溶解并释放自噬体，形成自噬溶酶体。最后，蛋白在自噬溶酶体中降解为氨基酸并释放入细胞质。自噬终产物可用于蛋白合成或经线粒体电子传递链氧化产生三磷酸腺苷为细胞供能。

　　目前，自噬对肿瘤的作用引起了科学界的极大兴趣，因为许多化疗药物可诱导肿瘤细胞自噬。据张志才等研究发现，化疗药物顺铂能有效诱导骨肉瘤MG-63细胞发生自噬,且在不同的作用时间与凋亡呈现出相反的效应,即在早期,自噬作为一种防御机制发挥了保护作用；在顺铂作用后期，作为另一种死亡形式和凋亡一起促进细胞死亡。总体来说，化疗作为肿瘤的标准治疗方法已有50年历史，是多种肿瘤最有效的治疗方法。过去人们认为药物诱导细胞死亡的机制只有凋亡与坏死。如今研究发现细胞自噬也是诱导细胞死亡机制之一。

　　“自噬性细胞死亡”是一种重要的细胞死亡形式，它是由细胞自噬（细胞消耗）水平过度导致的细胞内容物的大量降解。这种细胞死亡类型存在大量的自噬标志物以及特有的形态特征。通常，细胞自噬的形态学特征为染色质凝聚缺失及胞质空泡形成。相反，凋亡的特征为染色质凝聚、胞质膜出泡及凋亡小体形成。此外，自噬过程中无半胱天冬酶参与，它可特征性将LC3-Ⅰ酶切并脂化为LC3-Ⅱ，并降解另一种重要的蛋白p62/SQSTM1。与之相反，凋亡是一个半胱天冬酶依赖的过程，该过程涉及DNA降解及细胞破裂。最后，在自噬过程中，自噬细胞的溶酶体系统可破坏并清除自噬囊泡，而在凋亡过程中，凋亡小体被机体巨噬细胞识别并吞噬。

　　2骨肉瘤自噬的调节

　　目前研究发现多种机制可调节细胞自噬过程。其中PI3K/AKT/mTOR通路引起了研究者的广泛关注。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）在细胞的增殖、生长、分化过程中起着中心调控点的作用，一直被认为是抗肿瘤药物的重要靶点。mTOR激酶位于营养传感器PI3K的下游，可在机体营养不良时反应性下调自噬作用。该过程是由细胞代谢所必须的多种蛋白磷酸化完成的。当机体处于正常营养状态时，激活PI3K/AKT/mTOR通路抑制自噬作用，细胞正常增殖；而当细胞供养不足或在压力状态下，机体抑制mTOR并激活自噬作用。一项基础研究发现，mTOR靶向药物FIM-A可通过干预mTOR信号通路相关因子对骨肉瘤MG-63细胞的增殖发挥显著的抑制作用。

　　骨肉瘤患者体内最常见的自噬诱导机制为通过上游其他介质介导Beclin1的激活。Beclin1自噬相关关键调控因子（Barkor）是一种克隆自噬特异性蛋白，在U2OS人骨肉瘤细胞的自噬诱导中起到关键作用：在饥饿状态下，Barkor基因沉默U2OS细胞LC3-Ⅱ及自噬体合成减少，从而细胞自噬减少。使Barkor再表达后细胞自噬活动增加。这种情况下，Barkor可直接与Beclin1相互作用并与UV放射抵抗基因产物（UVRAG）竞争，从而诱导细胞自噬。其中，UVRAG为连结于Vps34复合体的附加基因。除此之外，经抗肿瘤化合物2-甲氧基雌二醇处理过的人SaOS骨肉瘤细胞可上调p53的靶基因，即受损调节自噬调节剂（DRAM），并增加c-JunNH2端激酶（JNK）的活性，这反过来可诱导Bcl-2的磷酸化作用，并激活Beclin1/Vps34复合体，从而激活细胞自噬。低氧是实体瘤的共同特点，研究显示它可无需低氧信号介质即低氧诱导因子（HIF）而通过某种机制促进一种多功能信号采集贮存蛋白1（SQSTM11/p62）的降解，从而诱导细胞自噬。进一步研究显示，视网膜母细胞瘤（Rb）基因可抑制E2转录因子1（E2F1）的表达，反过来下调Bcl-2，从而激活Beclin1/Vps34复合体，进而激活骨肉瘤细胞自噬。Jiang等将Rb引入SaOS-2人骨肉瘤细胞中发现Beclin-1表达升高，证实其可诱导细胞自噬。实验观察到mTOR磷酸化中无相关改变，提示Rb诱导的细胞自噬与其关系不大，而与E2F1介导的Bcl-2表达相关。此外，受体相互作用蛋白3（RIP3）是一种重要的坏死介质，有研究显示它参与了以保护性机制激活U2OS人骨肉瘤细胞自噬。此外，高迁移率族蛋白1（HMGB1）是一种染色体绑定核蛋白，它可控制Beclin1/Vps34复合体的形成并降低骨肉瘤细胞对化疗的敏感度，从而诱导细胞自噬。

　　信号转导和转录活化因子3（signaltransducersandactivatorsoftranscription,STAT3）是STAT家族重要成员之一，在肿瘤的增殖、分化和血管形成中发挥着重要作用。在正常组织细胞中，STAT3仅有少量和短暂的表达，而在多种恶性肿瘤组织中则表现为持续性的高表达。陈晓东等研究证实，骨肉瘤组织中存在STAT3的高表达，STAT3的表达不仅与其分期有关，而且与有无软组织浸润有关，通过对骨肉瘤的血管形成的促进而发挥。近年来微小RNA（miRNAs）与自噬相关性备受关注，它参与了物体生长发育、细胞增殖、肿瘤抑制等多种病理生理过程。据林松等研究表明，miR-101通过降低细胞自噬而影响癌细胞侵袭性从而有效抑制骨肉瘤细胞侵袭和自噬。最近发现PI3K/Akt/mTOR通路与人LM7及鼠K7M3骨肉瘤细胞自噬的激活相关，用吉西他滨处理骨肉瘤细胞能降低Akt及mTOR磷酸化作用以及Beclin1/Vps34复合体活性，从而诱导骨肉瘤细胞自噬。大量证据表明骨肉瘤细胞中存在细胞自噬。其过程涉及多个中间产物。尽管如此，自噬的结果最终取决于引物、肿瘤细胞类型、分期及其所处环境。

　　3自噬对骨肉瘤的影响

　　许多药物可引起骨肉瘤的细胞自噬，导致肿瘤对药物敏感度增加或诱导其耐药。具体而言，研究发现姜黄素、水鬼蕉碱及老刺木胺（VOA）等天然产物可增加骨肉瘤细胞对细胞毒性化疗药物的敏感度。研究人员观察到，VOA可诱导多重耐药（MDR）U2OS人骨肉瘤细胞的自噬行为。阿霉素治疗MDRU2OS时加入VOA可提高细胞死亡率。治疗前使用自噬抑制剂，或使用siRNA转染骨肉瘤细胞Atg基因，可调控细胞自噬，从而降低VOA对阿霉素导致的细胞毒性作用。研究发现，BH3类似物、GX15-070也可促进U2OS人骨肉瘤细胞死亡。使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤及氯喹通过2种不同机制进行治疗可加强GX15-070的细胞毒性。有趣的是，顺铂、阿霉素及甲氨蝶呤这三种化疗药均为骨肉瘤标准治疗方案，文献报道其可诱导骨肉瘤细胞自噬并通过诱导肿瘤细胞化疗抵抗来提高肿瘤细胞存活率。

　　总之，自噬在肿瘤细胞对化疗药物敏感度及抵抗性方面起着复杂的作用。自噬在骨肉瘤中有着双重作用，既能增加肿瘤细胞的耐药性而提高肿瘤细胞的存活率，也是化疗药物诱导细胞发生死亡的机制之一。