人脑脊液的代谢组学研究标识恶性神经胶质瘤的特征

　　脑疾病病人的脑脊液（CSF）通常用来诊断和监测研究，但是恶性胶质瘤病人脑脊液组成的变化很少被人们所知。该研究作者建立了靶向代谢组学分析方法，采用SRM监测模式，使用正负离子切换的方法在CSF中鉴定到了124种极性代谢物。样品来源于10例胶质瘤病人与7例对照。采用多种统计手段对数据进行分析，为神经性疾病生物标志物的发现提供参考。

　　10位胶质瘤病人包含4例新诊断的胶质瘤病人及6例复发病人。7例对照未诊断出任何胶质瘤。除了3号病人通过脑室采集CSF外，其余均通过腰椎穿刺采集。样品采自27-67岁的男性和女性患者，样品保存于-80℃冰箱直至测定。同时测定了一些临床指标如白细胞计数、血清总蛋白水平、血糖水平、LDH水平等（见表1）。测定的肿瘤指标包括肿瘤进程、生存期、肿瘤大小等。对于CSF的前处理，作者向250μL脑脊液样品中加入80%甲醇，-20℃下沉淀蛋白过夜。之后在4℃下13000rpm离心10min。取上清液吹干，用50μL水-乙腈（95:5）复溶。13000rpm离心5min，取上清液吹干，保存于-80℃冰箱。样品用20μL水（质谱级）复溶，取10μL进液质分析。

表1胶质瘤病人的基本信息及临床参数

　　靶向分析的LC-MS/MS条件如下：采用QTRAP 5500（AB/SCIEX）和UFLC （岛津）分析系统。质谱共设定了285个SRM离子对，并采用正负离子切换的模式检测。喷嘴电压（正离子模式）：+4900V，喷嘴电压（负离子模式）：-4500V；源温：475℃； dwell time：4ms； cycle time：1.89s；色谱柱采用Luna NH2 HILIC（Phenomenx, Torrance,CA）；流速：300μL/min；流动相A：20mM氢氧化铵和20mM乙酸铵（pH=9.0）水溶液：乙腈（95:5），流动相B：乙腈；洗脱梯度：0-5min：85-40%B；5-16min：40-0%B;16-24min，0%B；24-25min，0-85%B；25-32 min，85%B。

　　所有的统计计算使用CRAN软件完成（http://www.r-project.org/）。只要是在某一个样本中未检测到的化合物都被舍弃，保证分析结果更可靠。这一步使得化合物数量从254个降低到124种。之后作者使用PCA分析、分层聚类、k均值聚类分析对数据进行挖掘，并利用KEGG数据库分析代谢通路。

　　恶性神经胶质瘤CSF特有的代谢特征：采用无监督的分层聚类算法发现，胶质瘤病人CSF与对照组相比，其中代谢物水平有升高或降低（图1A）。树状图（图1B）显示的三个分支分别代表两组胶质瘤病人和一组正常样本。有意思的是，新诊断的胶质瘤病人（1、2、5、7号）与其他样本不在同一分支。图1C显示了区分胶质瘤和正常样本的各个代谢物做出的贡献。总之，这种分层聚类算法不仅区分了胶质瘤病人和对照组，而且还能够区分新诊断的胶质瘤病人和复发病人。这些信息是无法从MRI上获得的。

图1 CSF代谢物组成的分层聚类分析

　　作者也进行了PCA分析，发现前3种主成分表现出显著性差异（*，p=8.3×10-15; ** ,p=2.6×10-5; ***, p=1.8×10-9），分别占变异的28.1%、15.3%、13.9%（图2A）。为了进一步解释这些成分，作者将前40个主成分导入KEGG数据库，得到代谢物的通路分析结果。其中嘧啶代谢对2种主成分都做出了贡献（图2C）。代谢物来自三羧酸循环（n=5）、糖异生（n=4）、嘧啶代谢（n=4）为第一个主成分做出贡献；代谢物来自尿素循环（n=4）、嘧啶代谢（n=4）为第2种主成分做出贡献；代谢物来自蛋白质生物合成（n=7）、尿素循环（n=4）、嘌呤代谢（n=4）为第3种主成分做出了贡献。这些发现说明体内生化反应可以区分胶质瘤和正常样本。

　　代谢物在前两种主成分下的得分图如图2D，可以看出胶质瘤病人聚成两簇，并且与正常样本相区分。采用k均值聚类分析，将不同化合物对各簇的贡献标示以不同的颜色，发现结果相同。说明无论是分层聚类、PCA还是k均值聚类分析都可以获得相同的结果，只是利用数据的不同方面。

图2 CSF代谢物组成的PCA分析及k均值聚类分析

　　作者接下来分析了胶质瘤与正常样本存在差异的化合物，采用双侧t检验分析，39个化合物存在显著性差异（p<0.05）（图3A，表2）。这些代谢物来源于多种代谢途径，包括氨基酸、脂质、嘧啶、中心碳原子代谢。胶质瘤对代谢的改变直接来源于体细胞突变，比如MYC扩增、PTEN缺失、蛋白质丢失、EGFR扩增、IDH1/IDH2突变。作者在3号病人脑脊液中检测到高水平的2-羟戊二酸，说明此病人可能是IDH1突变的胶质瘤；肿瘤复发病人（3、10号）样本中发现三羧酸循环中的代谢物显著富集（图3B），说明这些化合物可以用来提示肿瘤复发的可能；新诊断的胶质瘤病人中发现有7种代谢物与复发病人存在显著性差异（p<0.05）（图3C）。其中有很多代谢物涉及组氨酸和色氨酸代谢，包括吲哚乙酸、吲哚、组氨酸、邻氨基苯甲酸盐。这条代谢途径中的吲哚2,3加氧酶通常作为免疫功能的一个生物标志物，故上述代谢物水平的变化可以反映这些病人的免疫功能变化。

表2胶质瘤病人与对照组相比代谢物的变化情况

图3恶性胶质瘤类型的代谢物特征分析及与临床指标相关性分析

　　与临床参数的相关性：临床上采用两个参数来评价胶质瘤病人的肿瘤大小，分别是Tgad和FLAIR。作者将以上两种手段观察到的肿瘤大小与检测的代谢物关联起来，发现有8个代谢物与Tgad相关，10个代谢物与FLAIR相关（R2>0.50）。并且有6个代谢物与Tgad和FLAIR均相关， 4个呈正相关，2个呈负相关；另一感兴趣的指标是生存期，作者发现有14个代谢物与生存期相关（R2>0.50）。（表3）其中3个代谢物（泛酸酯、生物素、氨基乙磺酸）可从食物中摄取故在CSF中能够检测到，其余代谢物为核苷酸和氨基酸代谢的中间产物。

　　CSF中肌醇水平降低，胆固醇硫酸酯水平升高与Tgad和FLAIR检测到的肿瘤大小呈线性相关（图3D）。肌醇是一个脑渗透性化合物，用磁共振光谱检测，其在恶性胶质瘤和细胞瘤中的水平比低级别胶质瘤和正常脑组织中的水平低。该研究也显示肿瘤大小与CSF中肌醇水平呈负相关；CSF中胆固醇硫酸酯水平与肿瘤大小正相关。胆固醇硫酸酯参与人支气管上皮细胞鳞状上皮生化过程，这也就暗示该代谢物来自正常组织的致癌性转化。

表3与临床指标Tgad、FLAIR、生存期相关的代谢物

　　作者等人用恶性胶质瘤的小组样本，构建了人脑脊液的整体代谢组学轮廓。研究发现，用少量样本即可以显著区分胶质瘤病人与正常病人。开发了一种正负离子模式切换的LC-MS/MS方法用于代谢物检测。采用无监督的分类算法来寻找病人样本间的总体差异，并研究与系统性癌症相关代谢的生理学特点。尽管该研究中的样本量较小，但某些代谢物水平的显著差异暗示从脑脊液中发现代谢生物标志物有很大潜力，代谢物特征同样可以作为诊断标志物。作者等人希望该研究可以扩展代谢组学技术的适用性，并且促进CSF中的代谢物分析为未来大样本的肿瘤学临床研究提供参考。