肿瘤治疗要不要看心情？

　　罹患恶性肿瘤对于患者是一种独特的心理体验，绝大多数肿瘤病人承受不同程度的精神压力，悲观、恐惧、焦虑等情绪常伴随肿瘤的诊断、手术、治疗全过程。继体温、呼吸、心跳、血压和疼痛之后，心理压力及情绪异常被定义为肿瘤患者的“第六大生命体征”。大量流行病学的研究结果表明，患者心理及情绪因素对肿瘤的进展及患者的预后产生重要影响，然而其机制尚不清楚。军事医学科学院础医学研究所郭宁教授课题组最近发表在Oncogene杂志上的研究发现儿茶酚胺及其重要受体β2肾上腺素能受体在乳腺癌靶向治疗疗效中的影响，为我们揭示心理压力对肿瘤疗效的影响的分子机制的一种可能，研究结果很有趣也很有意义。

　　β2肾上腺素能受体激活诱导Her2阳性乳腺癌细胞赫赛汀耐药的分子机制研究

　　乳腺癌是一类严重威胁女性健康的恶性肿瘤，原癌基因Her2在20%-30%乳腺癌患者中过表达，靶向Her2的治疗性抗体赫赛汀现为乳腺癌临床治疗的一线用药，但耐药成为制约其临床疗效的关键问题。首先赫赛汀单独应用时反应率低（约12%-34%），表明多数患者对赫赛汀呈原发性耐药，其次大多数赫赛汀初始治疗有效的乳腺癌患者（约66%-88%）在用药1年内则可发生赫赛汀继发性耐药。迄今为止，赫赛汀原发性及继发性耐药的机制仍不清楚。

　　肿瘤患者均承受不同程度的精神压力而长期处于悲观、恐惧、焦虑等不良应激状态，负面情绪可能贯穿肿瘤诊断、手术、放化疗全程。机体对于慢性心理应激刺激的应答主要是通过交感神经系统兴奋和下丘脑-垂体-肾上腺轴激活来实现的。应激反应刺激下丘脑-垂体-肾上腺轴及交感神经系统释放儿茶酚胺，与广泛存在于组织器官中的β肾上腺素能受体（β-AR）结合，触发β-AR介导的信号级联反应，导致cAMP合成、蛋白激酶磷酸化及转录因子激活，从而引发细胞生物学行为的改变。体外研究结果显示，肾上腺素能信号可调控多种与肿瘤发生发展相关的基因表达，影响肿瘤细胞的生物学行为，包括肿瘤细胞增殖、细胞外基质侵袭、血管发生、基质金属蛋白酶（MMP）激活及炎性细胞因子和趋化性细胞因子表达等。因此，慢性应激引起的体内儿茶酚胺等神经递质及神经内分泌激素持续、过度释放，可能在肿瘤的发生、发展、治疗过程中发挥重要的作用。

　　我们前期研究结果揭示，1）乳腺癌组织中儿茶酚胺的重要受体β2肾上腺素能受体（β2-AR）的表达水平显著升高，β2-AR与Her2在乳腺癌组织中共表达，表达水平具有明显的相关性；2）高表达Her2的乳腺癌细胞可通过激活ERK信号通路，促进儿茶酚胺合成酶的表达，诱导肿瘤细胞自分泌肾上腺素，实现肿瘤细胞β2-AR信号通路的自我激活。且该效应在Her家族配体Herregulin的刺激下会进一步增强；3）儿茶酚胺可通过活化STAT3，促进Her2转录，导致Her2表达水平升高及活化，过表达Her2亦可导致β2-AR的表达上调，二者在乳腺癌细胞中的表达构成正反馈调控环路；4）Her2过表达乳腺癌细胞在儿茶酚胺刺激下增殖活性明显增强，提示β2-AR与Her2的交互作用可能产生了更强的增殖信号，从而不仅可能影响乳腺癌细胞的生物学行为，而且可能影响其对靶向Her2的抗肿瘤药物的敏感性。更为有趣的是，儿茶酚胺诱导β2-AR信号通路活化产生的效应可能拮抗了多种已知的赫赛汀抗肿瘤机制。1）儿茶酚胺刺激Her2阳性乳腺癌细胞，激活了β2-AR介导的信号级联反应，促进了肿瘤细胞的增殖。拮抗了赫赛汀抗肿瘤细胞增殖效应。2）β2-AR与Her2在乳腺癌细胞中可形成正反馈表达调控环路，活化了Her2下游重要促生存信号通路，增强促生存信号，由此拮抗了赫赛汀抑Her2下游信号通路活性的效应。3）儿茶酚胺诱导β2-AR活化可同时激活乳腺癌细胞内两个重要的转录因子（STAT3和AP-1），这两个转录因子以协同调控的方式增强肿瘤细胞内基质金属蛋白酶的表达，而该类分子的表达参与肿瘤血管生成，因而可能拮抗赫赛汀抑制血管生成效应。基于上述研究发现，我们提出本次研究设想，即β2-AR介导的信号通路激活可能影响Her2阳性乳腺癌细胞对赫赛汀的反应性。首先我们收集了83例经赫赛汀新辅助治疗的Her2阳性乳腺癌患者的组织标本，应用β2-AR特异性抗体对其进行染色，根据染色强度将患者分为β2-AR高表达组和β2-AR低表达组，同时按治疗后是否达到病理完全缓解（pCR）将患者分为pCR组和nopCR组，Wilcoxon秩和检验和Cochran-Armitage趋势卡方检验结果均提示β2-AR表达水平与赫赛汀耐药密切相关。β2-AR表达水平越高，赫赛汀的反应性越差，患者的预后越不好（Fig.1a-e）。

　　Fig.1

　　β2-AR表达水平与赫赛汀疗效之间存在相关性。A，β2-AR免疫组化结果评分；B、C，Wilcoxon秩和检验结果；D，卡方检验分析结果；E，Cochran-Armitage趋势卡方检验分析结果

　　我们已发表的研究论文揭示，乳腺癌细胞中β2-AR与Her2形成正反馈表达调控环路，儿茶酚胺刺激激活β2-AR信号，上调Her2分子的表达，活化PI3K-Akt和ERK信号通路，并最终产生更强的增殖信号。本次研究通过免疫印迹法在两种高表达Her2的乳腺癌细胞（BT474和MCF-7/Her2）中再次验证了儿茶酚胺刺激对Her2分子表达及其下游信号通路活性的激活效应，而且进一步发现β2-AR与赫赛汀联用可显著逆转赫赛汀对Her2表达及其下游AKT/ERK信号的抑制效应，并最终拮抗赫赛汀抑肿瘤细胞增殖效应（Fig.2a-d）。体内试验的结果亦证实，赫赛汀单独应用可显著抑制移植瘤的增殖，而在儿茶酚胺存在的情况下，赫赛汀的抑瘤活性受到明显的抑制（Fig.2e）

　　Fig.2

　　β2-AR激动剂在体内外均可拮抗赫赛汀的抑增殖效应。A，β2-AR激动剂刺激BT474和MCF-7/Her2细胞检测ERK及AKT信号通路活化；B，β2-AR激动剂刺激BT474和MCF-7/Her2细胞检测Her2表达及其磷酸化；C，β2-AR激动剂刺激BT474和MCF-7/Her2细胞检测Her2表达、活化及其下游ERK、AKT的磷酸化；D，同时用ISO(异丙肾上腺素)和赫赛汀处理乳腺癌细胞，ISO可显著拮抗赫赛汀的抑增殖效应，且具有量效关系

　　miRNA是一类广泛存在于真核生物中的单链小分子非编码RNA，通过调控其下游靶基因的表达，参与多种病理生理过程，是潜在的药靶和生物标记物。我们通过qPCR的方法检测到儿茶酚胺的刺激可以在两种Her2阳性的乳腺癌细胞中上调miR-21的表达（Fig.3a）。已有研究表明PI3K-Akt信号通路的重要负调控分子Pten是miR-21的下游靶基因。由此我们推断，儿茶酚胺的刺激通过上调miR-21表达，抑制Pten表达，最终导致PI3K-Akt信号通路的异常活化。WesternBlot的结果验证了这一设想，我们发现儿茶酚胺的刺激确实可以显著下调Pten的表达，而过表达miR-21inhibitor，抑制miR-21的表达后，Pten的表达得以恢复（Fig.3b-c）。

　　Fig.3

　　β2-AR活化上调miR-21表达，抑制Pten表达。A，β2-AR激动剂刺激MCF-7/Her2细胞检测pre-miR-21和mature-miR-21表达。β2-AR激动剂刺激BT474细胞检测mature-miR-21表达；B，β2-AR激动剂刺激MCF-7/Her2细胞检测Pten表达。β2-AR激动剂刺激miR-21inhibitor过表达的MCF-7/Her2细胞检测Pten表达；C，β2-AR激动剂刺激miR-21inhibitor过表达的BT474细胞检测Pten表达

　　通过qPCR检测发现，儿茶酚胺刺激活化β2-AR信号可以在两种Her2阳性乳腺癌细胞中显著抑制miR-199a/b-3p的表达（Fig.4a）。已有文献证实mTOR是miR-199a/b-3p的靶基因，因此我们提出假设：即β2-AR信号活化可能通过抑制miR-199a/b-3p上调其靶分子mTOR表达，造成PI3K-Akt-mTOR信号通路异常激活，导致乳腺癌细胞对赫赛汀的反应性降低，表现为赫赛汀耐药。WesternBlot结果初步验证了这一假设，我们发现两种高表达Her2的乳腺癌细胞中，儿茶酚胺刺激均可显著增强mTOR的表达及活化，但通过转染miR-199a/b-3pmimics，恢复miR-199a/b-3p表达后，mTOR的诱导表达上调受到明显抑制。（Fig.4b-c）。体外增殖实验的结果亦证实，与对照细胞相比，感染miR-199a-2慢病毒（购自上海吉凯基因公司）后的乳腺癌细胞对赫赛汀更为敏感，赫赛汀的抑增殖效应更明显（Fig.4d）。

　　Fig.4

　　β2-AR活化抑制miR-199a/b-3p表达，诱导mTOR表达、活化。A，β2-AR激动剂刺激MDA-453和MCF-7/Her2细胞检测miR-199a/b-3p表达；B，β2-AR激动剂刺激BT474和MCF-7/Her2细胞检测mTOR表达、活化；C，β2-AR激动剂刺激过表达miR-199a/b-3pmimics的BT474和MCF-7/Her2细胞检测mTOR表达；D，在乳腺癌细胞中使用慢病毒过表达miR-199a-2可显著增强拮抗赫赛汀的抑增殖效应

　　最近，有研究者发现MUC-1蛋白与赫赛汀耐药的发生关系密切，但具体的机制不清楚。MUC-1是一个高分子量，高糖基化的跨膜黏蛋白，是重要的肿瘤生物学标志物。其胞内域存在一段高度保守的序列可以被多种酪氨酸激酶磷酸化，在肿瘤信号转导中发挥重要作用。已有研究发现MUC-1是STAT3的下游信号分子，可与STAT3形成正反馈调控环路。而且最近一篇关于非小细胞肺癌的研究揭示MUC-1表达异常增强可以激活PI3K-Akt信号通路。由此我们有理由推断，儿茶酚胺刺激诱导β2-AR活化，激活乳腺癌细胞内STAT3信号分子，上调MUC-1表达，进而造成PI3K-Akt信号通路活性异常升高。首先，我们在儿茶酚胺诱导的两种Her2阳性乳腺癌细胞中检测了上述信号分子的表达、活化，结果显示：儿茶酚胺刺激可以显著上调STAT3和AKT的磷酸化水平，诱导MUC-1表达增强（Fig.5a）。继而，我们运用STAT3特异性siRNA敲低STAT3表达，发现儿茶酚胺刺激诱导MUC-1表达上调的效应被显著抑制，提示儿茶酚胺刺激通过活化STAT3上调MUC-1的表达水平（Fig.5b）。同样当我们用MUC-1的特异性siRNA敲低MUC-1表达后，儿茶酚胺刺激不能再显著上调AKT的磷酸化水平，提示儿茶酚胺刺激β2-AR活化，通过增强MUC-1的表达影响AKT信号通路活性（Fig.5c）。

　　Fig.5

　　儿茶酚胺刺激激活STAT3，上调MUC-1表达，活化AKT信号。A，β2-AR激动剂刺激BT474和MCF-7/Her2细胞检测MUC-1表达，STAT3和AKT磷酸化；B，STAT3siRNA敲低STAT3表达检测MUC-1的表达水平；C，MUC-1siRNA敲低MUC-1表达检测AKT的表达、活化

　　上述研究结果提示我们：β2-AR及其信号可能在赫赛汀耐药过程中发挥关键作用:（1）儿茶酚胺刺激活化β2-AR信号，上调miR-21表达，抑制PI3K-Akt信号通路重要负调控分子Pten的表达，；（2）β2-AR信号活化激活STAT3信号通路，上调MUC-1表达，造成AKT磷酸化水平异常升高；（3）β2-AR信号活化抑制miR-199a/b-3p表达，上调靶分子mTOR表达水平（Fig.6）。综上所述，儿茶酚胺刺激激活β2-AR信号，通过协同调控多个关键信号分子最终导致PI3K/Akt/mTOR信号通路的异常活化，诱导乳腺癌细胞对赫赛汀产生抗性。由此可见，β2-AR是诱导赫赛汀耐药发生的重要节点分子，可将其作为预测赫赛汀反应性的靶标分子，更重要的是调控该分子的活性可能成为逆转赫赛汀耐药的可行性策略。

　　Fig.6

　　赫赛汀发挥抑瘤效应及β2-AR信号活化诱导乳腺癌细胞赫赛汀耐药分子机制示意图

　　为此，我们开展了以下研究：首先我们对94例接受过赫赛汀治疗的Her2阳性转移性乳腺癌患者的临床资料进行了回顾性分析，根据是否服用β-AR拮抗剂将患者分为赫赛汀治疗组（63例）和赫赛汀+β-AR拮抗剂治疗组（31例）。统计分析结果显示，赫赛汀+β-AR拮抗剂治疗组的疾病无进展生存期（PFS）显著长于赫赛汀治疗组（Fig.7a）。为了进一步验证上述研究结果，我们构建了高表达Her2的乳腺癌细胞（MCF-7/Her2）的裸鼠移植瘤模型，用赫赛汀、普纳洛尔或普纳洛尔+赫赛汀处理荷瘤鼠，发现普纳洛尔可显著增强赫赛汀的抑瘤活性（Fig.7b）。同时我们收集了上述动物实验的移植瘤组织标本，应用细胞增殖标记物Ki67和血管内皮细胞标记物CD31的特异性抗体进行免疫组化染色，并对阳性细胞比例和染色强度进行量化分析。结果显示，普纳洛尔与赫赛汀联用可显著降低肿瘤细胞的增殖活性，抑制肿瘤新生血管生成（Fig.7c-d）。

　　Fig.7

　　β-AR拮抗剂与赫赛汀联用可改善患者预后，增强赫赛汀体内抗增殖效应和抑制血管生成效应。A，Kaplan-Meier分析口服β-AR拮抗剂对赫赛汀治疗患者PFS的影响；B，β-AR拮抗剂与赫赛汀联合处理荷瘤小鼠检测移植瘤体积的动态变化；C，应用Ki67抗体对上述动物实验的瘤组织进行免疫组化染色及量化分析的结果；D,应用CD31抗体对上述动物实验的瘤组织进行免疫组化染色及量化分析的结果

　　本项研究揭示了赫赛汀耐药的分子机制、鉴定了赫赛汀抗性相关靶点，同时为逆转赫赛汀耐药策略的建立提供了理论依据并进行了初步探索，对于乳腺癌新型治疗方案的建立、改善乳腺癌患者的预后具有重要的临床意义。