骨硬化蛋白在骨重塑中作用研究进展

　　骨硬化蛋白在骨重塑中作用的研究进展

　　骨重塑是骨发育完成后机体骨组织持续更新的过程，贯穿机体的一生，主要包括骨形成、骨吸收。通过骨形成和骨吸收的相互协调，骨重塑维持骨骼发育完成后的骨量及骨骼的形状。骨重塑是一个复杂的过程，涉及间充质干细胞(MSCs)、成骨细胞、破骨细胞、骨细胞、内皮细胞等多种细胞，以及由细胞分泌的骨形态发生蛋白、血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子等多种生长因子。近些年来的研究揭示了骨细胞在骨重塑中的重要作用[1]。骨细胞通过分泌骨硬化蛋白抑制Wnt/β-catenin信号通路，从而抑制成骨细胞分化、增殖，最终发挥强有力的抑制骨形成的作用[2]。多种类型骨质疏松患者血清中均存在骨硬化蛋白含量特异性的改变。因此，通过骨硬化蛋白抗体拮抗骨硬化蛋白的作用成为治疗多种骨质疏松的潜在方法之一，并且已经取得了显著的实验与临床效果[3,4]。另一方面，研究显示应用骨硬化蛋白抗体能够加速骨折愈合、骨缺损修复[5,6]。

　　笔者以"骨硬化蛋白""骨细胞""骨质疏松""骨折""骨重塑"或"sclerostin""osteocyte""osteoporosis""fracture""boneregeneration"等为关键词，在万方、维普、PubMed、Medline等数据库进行检索，检索时间为2001年3月—2016年10月。重点筛选近5年文献，检索语种为中文或英文。共检出中文文献321篇，英文文献838篇。文献纳入标准：(1)文献为期刊论文；(2)研究内容涉及骨硬化蛋白与骨质疏松、骨折、骨重塑；(3)研究对象为人、动物或离体细胞。排除标准：(1)文献类型为评论、讲座、会议论文、学位论文；(2)重复发表或内容相近的文献；(3)无法获得全文、无详细摘要的论文。最终纳入中文文献4篇，英文文献60篇。笔者就相关最新文献进行综述，以利于进一步认识骨硬化蛋白在骨代谢过程中的重要作用。

　　1骨硬化蛋白及其对骨形成的促进作用

　　骨骼组织中的细胞包括成骨细胞、破骨细胞、骨细胞、MSCs等。骨细胞来源于成骨细胞。60%～80%的成骨细胞通过凋亡而死亡；剩下的成骨细胞一部分转变为骨衬细胞，另一部分包埋到骨基质中成为骨细胞[7]。

　　骨重塑始于破骨细胞介导的骨吸收，吸收后的骨陷窝由成骨细胞产生的新生骨组织取代；骨吸收、骨形成处于动态平衡中，这样才能维持正常的骨量及骨结构。以往对骨重塑的研究主要集中在成骨细胞、破骨细胞。然而骨组织中数量最多的是骨细胞，占整个骨组织细胞总量的90%～95%以上，并且所占比例随着年龄增大而增多[1,8]。近年来，人们对骨细胞的作用有了更深的认识。大量的实验结果表明，骨细胞能够通过影响成骨细胞、破骨细胞对骨重塑起着"决定性"作用，因此有学者将骨细胞称为"骨重塑的驱动者"[9]。当骨细胞凋亡时，骨细胞发出信号使破骨细胞前体细胞向特定区域募集，分化为成熟破骨细胞，产生骨吸收，从而启动骨重塑过程。同时，凋亡骨细胞周围的骨细胞能够分泌核因子-κβ受体活化因子配体(RANKL)，促进破骨细胞分化[10,11,12,13,14]。另一方面，骨细胞能够通过分泌骨硬化蛋白抑制成骨细胞分化、促进成骨细胞凋亡，抑制骨形成[15,16,17,18]。

　　骨硬化蛋白是由位于染色体17q12～21上SOST基因编码的一种蛋白。SOST基因突变会导致骨硬化性骨病，而SOST基因下游转录调控区域的缺失会引起vanBuchem综合征[19,20]。这两种疾病均是退变性且以骨量异常增高、骨强度异常增加为特点的骨骼系统疾病；其根本病因就是患者体内骨硬化蛋白缺失。Wnt/β-catenin信号通路在MSCs向成熟成骨细胞分化过程中起着决定性作用。当Wnt/β-catenin信号通路激活后，Wnt与Firzzled受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRP5/6)共同受体结合，从而阻止Axin对β-catenin的水解，β-catenin随即进入细胞核启动下游基因的转录[21]。Wnt/β-catenin信号通路的主要拮抗剂是骨硬化蛋白和DKK-1。骨硬化蛋白由埋藏于骨基质中的成熟骨细胞分泌，通过竞争绑定LRP5/6共同受体，阻止Wnt、Firzzled受体及LRP5/6复合体形成，下调成骨细胞的Wnt/β-catenin信号通路，从而抑制骨形成[22,23,24]。转基因小鼠的构建进一步证实骨硬化蛋白是骨形成强有力的抑制因子。敲除SOST基因的小鼠表现为进行性骨量增多，骨强度增高；而SOST基因过表达的小鼠骨量低下[2,15,24]。此外，有文献报道骨硬化蛋白还能通过作用于附近的骨细胞，使附近骨细胞分泌RANKL增加，从而提高RANKL/骨保护素(OPG)比例，促进骨吸收[25]。

　　2骨硬化蛋白与骨质疏松

　　骨硬化蛋白的表达可以由多种因素调控，包括机械力刺激、骨组织局部细胞因子、激素(雌激素、糖皮质激素、甲状旁腺素)、年龄等[23,26,27,28,29,30,31,32]。病理条件下，上述调控因素的改变往往也是骨质疏松的发病因素之一。目前多项临床研究表明，骨硬化蛋白含量在多种骨质疏松患者(废用性骨质疏松、绝经后骨质疏松、老年性骨质疏松、激素性骨质疏松)体内存在特定的变化，成为推动骨质疏松发生、发展的因素之一[1,3,4,29,30]。

　　作为骨骼组织中的机械刺激"感受器"，骨细胞能够通过感受机械负荷调节骨量；而"骨陷窝-骨小管"网络作为机械应力的"放大器"，能够增加骨细胞对机械应力的敏感性[26]。动物模型证实，增加尺骨的负荷使尺骨局部骨组织上表达的骨硬化蛋白降低；将小鼠悬吊，减少小鼠下肢的应力感受，小鼠胫骨骨组织表达的骨硬化蛋白上升[33]。如果将骨细胞置于非负重的环境进行培养，骨细胞分泌的骨硬化蛋白明显增加[23]。临床研究进一步证实应力刺激对骨硬化蛋白的调控作用：7例健康男性志愿者在长期卧床后血清中的骨硬化蛋白水平明显增高；40例发生过脑卒中的绝经后女性在卧床6个月后血清中的骨硬化蛋白水平增高，并且骨硬化蛋白含量与骨形成指标——骨特异性碱性磷酸酶(B-ALP)呈显著负相关[34,35]。另一方面，敲除SOST基因的小鼠即使在非负重的条件下也不会发生骨丢失，这表明骨硬化蛋白是废用性骨质疏松发病时骨丢失的关键因素[24]。

　　绝经后骨质疏松是女性绝经后常见的并发症之一，其机制主要是由于破骨细胞过度激活使骨转换异常增加，骨形成速率小于骨吸收，最终导致骨丢失[36]。最新的研究结果提示，雌激素水平下降后骨细胞分泌的骨硬化蛋白含量改变是引起绝经后骨质疏松发病的重要因素。Xu等[37]报告绝经后中国女性血清中骨硬化蛋白含量低于绝经前女性，并且骨硬化蛋白含量与腰椎骨密度呈正相关。He等[38]也认为，血清中骨硬化蛋白含量与腰椎、髋部骨密度成呈正比，与25羟-维生素D、血清中Ⅰ型胶原C端肽(CTX)呈负相关。通过皮下使用雌激素能够降低绝经后女性血清中骨硬化蛋白水平[39]。然而也有报道认为，绝经后女性血清中骨硬化蛋白含量高于绝经前女性[40,41]。尽管绝经后女性体内骨硬化蛋白含量变化目前存在争议，但绝经后女性体内骨硬化蛋白含量高被认为是绝经后女性脆性骨折高发的独立危险因素[42]。

　　由衰老导致的老年性骨质疏松主要与骨形成下降有关[1]。一项横断面研究提示，老年男性血清中骨硬化蛋白含量是青年男性的4.6倍，而老年女性血清中骨硬化蛋白含量是青年女性的2.4倍。因此，老年骨组织骨形成下降与骨硬化蛋白水平增高有关[43]。动物实验证实，高龄小鼠体内活性氧增加，活性氧能够上调小鼠胫骨骨组织内骨硬化蛋白mRNA和蛋白表达水平，同时抑制骨钙素等骨形成指标的表达[44]。

　　由糖皮质激素引起的骨质疏松是最常见的继发性骨质疏松，其发病机制主要与成骨细胞凋亡增加、分化障碍导致骨形成受到抑制、骨细胞凋亡增加、早期破骨细胞激活有关。短时间(≤6个月，≥7.5mg/d)使用糖皮质激素的患者血清中，骨硬化蛋白含量与对照组比较没有显著差异；当长时间使用激素后(≥12个月)，血清中的骨硬化蛋白含量明显增加[45]。另一项研究表明，使用糖皮质激素4d后，患者血清中的骨硬化蛋白含量明显下降；这可能与短时间内使用激素后使骨细胞大量凋亡，导致具备分泌骨硬化蛋白功能的骨细胞数量不足有关[46]。

　　3骨硬化蛋白抗体与骨质疏松

　　鉴于骨硬化蛋白对骨形成的抑制作用，以及骨硬化蛋白表达缺失后硬化性骨化病表现出的骨量、骨强度增加，人们尝试制作骨硬化蛋白抗体，并用于干预各种骨质疏松，取得了显著的实验和临床效果。

　　3.1实验研究

　　骨硬化蛋白抗体最早用于干预绝经后骨质疏松模型。实验选取6个月龄雌性大鼠，切除双侧卵巢后1年，骨质疏松模型建立成功后，利用骨硬化蛋白单克隆抗体(Scl-AbⅡ)干预老龄雌激素缺乏大鼠5周。实验结果提示，Scl-AbⅡ使切除双侧卵巢大鼠松质骨、皮质骨骨量得到恢复；并且骨量、骨强度均高于对照组。骨形态计量学结果表明，Scl-AbⅡ显著增加成骨细胞面积、骨形成速率、矿化面积等骨形成指标；同时明显降低了破骨细胞面积，使骨吸收得到抑制[3]。另一项实验利用Scl-AbⅡ干预切除双侧卵巢大鼠26周，干预组大鼠骨量呈渐进式增长，骨量增长与皮质骨、松质骨骨形成速率增加，破骨细胞活力减少有关。在干预的第6周，Scl-AbⅡ干预组骨吸收指标抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(TRAP-5b)与对照组比较明显下降，第26周TRAP-5b与对照组比较无显著差异，但破骨细胞侵蚀面积较对照组低80%。在骨形成指标方面，干预第6周时，Scl-AbⅡ干预组血清中的Ⅰ型前胶原氨基末端肽(PINP)、骨钙素及骨形成速率明显高于对照组；第26周时干预组PINP、骨钙素及骨形成速率水平仍高，但与对照组比较无差异[47]。

　　对于废用性骨质疏松的治疗，骨硬化蛋白抗体也展现出良好的效果。将5个月大小雄性小鼠悬吊1周后，小鼠血清中的PINP下降35%，ALP阳性细胞数下降51%，钙结节下降35%，而破骨细胞前体细胞上升了4倍；应用Scl-AbⅡ能够提高小鼠体内成骨细胞数量，增加骨矿化面积，降低血清中TRAP-5b含量[48]。脊髓损伤后由于失去力学刺激、神经损伤及激素紊乱，骨骼系统会发生骨量丢失。动物模型证实，完全脊髓损伤7周后骨密度下降25%，骨量下降67%；而在脊髓损伤后1周开始利用Scl-AbⅡ干预的大鼠骨量、骨密度与对照组比较无明显下降；扫描电镜结果显示，脊髓损伤后骨细胞胞体的形态由纺锤形变成圆形，Scl-AbⅡ干预则使骨细胞胞体形态恢复正常；体外结果显示Scl-AbⅡ能抑制破骨细胞形成，促进成骨细胞分化，以及促进LRP5、OPG/RANKLmRNA表达，同时下调DKK-1mRNA表达水平[4]。

　　Scl-AbⅡ能阻止糖皮质激素引起的骨量减少、骨强度下降，这与Scl-AbⅡ能够通过自噬途径维持成骨细胞功能有关[49]。

　　3.2临床研究

　　全球首个骨硬化蛋白抗体(AMG785/Romosozumab)Ⅰ期临床随机对照双盲研究于2011年发布。该临床研究选择72名健康的绝经后女性作为受试对象，接受单次骨硬化蛋白抗体注射，干预剂量为0.1，0.3，1，3，5，10mg/kg皮下注射，1，5mg/mg静脉注射，根据接受注射剂量不同，最长随访时间为85d。临床试验结果表明，随着干预剂量增大，骨硬化蛋白抗体以剂量依赖形式提高受试者血清中PINP、B-ALP和骨钙素含量，降低CTX含量；同时在干预结束时受试者腰椎骨密度上升5.3%，髋部骨密度上升2.8%[50]。另一项随机对照双盲临床研究招募了32名骨密度低的绝经后女性和16名骨密度低的健康男性，女性受试者接受1mg/kg或2mg/kgRomosozumab皮下注射，每2周1次；或者接受2mg/kg或3mg/kgRomosozumab皮下注射，每4周1次。男性接受1mg/kgRomosozumab皮下注射，每2周1次；或者3mg/kgRomosozumab皮下注射，每4周1次。干预12周后研究结果提示，Romosozumab使受试者血清中的PINP水平上升66%～147%，CTX水平下降15%～50%；使腰部骨密度上升4%～7%[51]。另一种骨硬化蛋白抗体Blosozumab在临床研究中也取得了良好的效果，使用Blosozumab8周后受试者腰椎的骨密度上升3.41%，髋部的骨密度上升7.71%[52]。2014年RomosozumabⅡ期多中心随机对照临床试验表明，Romosozumab治疗1年后腰椎骨密度上升11.3%，安慰剂对照组腰椎骨密度下降0.1%，阿仑膦酸钠阳性对照组腰椎骨密度上升4.1%，特里帕肽阳性对照组腰椎骨密度上升7.1%。这一结果提示，与阿仑膦酸钠、特里帕肽相比，Romosozumab对腰椎骨密度的提高具有一定的优势[53]。BlosozumabⅡ期随机对照临床试验表明，高剂量Blosozumab干预1年使受试者腰椎骨密度上升17.7%，髋部骨密度上升6.2%[54]。

　　4骨硬化蛋白与骨折愈合

　　骨折愈合也是骨重塑的过程，包括血肿机化期、骨痂形成期和塑形期。因为高能量创伤、软组织损伤、感染、糖尿病等多种因素，有5%～10%的骨折存在骨折愈合障碍[55,56]。因此，构建促进骨折愈合方法和措施显得尤为重要[57,58]。鉴于骨硬化蛋白在骨重塑中的重要作用及骨硬化蛋白抗体在全身应用后表现出的良好临床效果，不少学者致力于研究骨硬化蛋白在骨折愈合中的作用，并尝试利用骨硬化蛋白抗体促进骨折愈合。

　　有研究表明，骨折患者血清中的骨硬化蛋白含量在骨折早期呈下降趋势[59]。然而也有学者报告，骨折患者血清中的骨硬化蛋白水平高于对照组，并且骨折愈合障碍患者血清中的骨硬化蛋白含量明显低于骨折正常愈合的患者[60]。但该报道存在一个缺陷，即骨折愈合障碍患者例数较少，仅6例；而骨折愈合正常的患者为69例。

　　SOST敲除小鼠揭示了SOST基因在骨折愈合过程中的重要作用。SOST敲除小鼠骨折后14d，骨痂中的骨面积比野生小鼠多97%，软骨骨痂面积少40%；骨折后45d，SOST基因敲除小鼠骨折处的力学性能要明显优于野生型小鼠[61]。Ominsky等[62]通过闭合截骨方式建立大鼠股骨中段横行骨折模型，利用皮下注射Scl-AbⅡ干预骨折愈合进程。实验结果提示，Scl-AbⅡ能显著提高骨折处骨痂的骨质量和骨强度；在骨折愈合的10周，Scl-AbⅡ干预组大鼠骨折间隙更小，软骨骨痂含量、纤维血管组织更少，含有更多的矿化骨组织。Suen等[63]通过开放截骨建立大鼠股骨骨折模型，同时利用Scl-AbⅡ对大鼠进行系统干预。实验结果显示，Scl-AbⅡ能加速骨折愈合进程，表现在骨愈合过程中骨形成、骨质量、骨强度均得到了明显增加。1型糖尿病患者常常发生骨质疏松、脆性骨折及骨折愈合障碍，其机制主要是胰岛素绝对缺乏后导致的骨形成障碍。Yee等[64]通过系统应用Scl-AbⅡ干预1型糖尿病小鼠骨折模型，取得了明显的效果：Scl-AbⅡ使1型糖尿病小鼠全身骨量、骨密度增加，骨折后第11，14周，Scl-AbⅡ干预糖尿病小鼠骨痂处骨体积/组织体积(BV/TV)、骨密度、骨矿物含量要明显多于糖尿病小鼠，同时免疫荧光提示，Scl-AbⅡ干预组骨痂处的Runt家族转录因子-2(Runx-2)、骨钙素、Ⅰ型胶原等骨形成指标较糖尿病组均有明显上升。

　　在骨缺损愈合研究领域，Virk等[5]建立了大鼠股骨极限性节段骨缺损模型，同时利用Scl-AbⅡ进行干预。实验结束时，对照组大鼠股骨骨缺损处均未形成骨性愈合；而Scl-AbⅡ连续干预组中有4只大鼠骨缺损处愈合(4/15)，早期干预组有3只大鼠骨缺损处达到骨性愈合(3/15)，晚期干预组有4只大鼠股骨骨缺损处完全愈合(4/15)。结果表明，Scl-AbⅡ对骨生长具有强有力的诱导作用。

　　5总结与展望

　　通过干预病理条件下的骨重塑进程，尤其是促进骨形成，被认为是防治骨质疏松、促进骨折愈合和骨缺损修复理想的方法和措施。由于骨硬化蛋白能够通过抑制Wnt/β-catenin信号通路而抑制成骨细胞分化，降低骨形成速率，因此从理论上讲，制备和系统性应用骨硬化蛋白抗体能够有效地加速骨重塑，有利于骨改建。大量实验研究充分证实，骨硬化蛋白抗体对多种骨质疏松症具有有效的防治作用，同时还能够显著促进骨折愈合、骨缺损修复。更为重要的是，骨硬化蛋白抗体Ⅰ期、Ⅱ期临床研究结果提示，骨硬化蛋白抗体不但能有效防治绝经后骨质疏松，并且与一些传统抗骨质疏松药物相比药效更为显著。骨硬化蛋白抗体有望成为一种全新的抗骨质疏松药物，必要时使用能够促进骨折愈合及骨缺损修复。但这两方面应用仍需在临床试验中加以证实。