绝经后骨质疏松症患者骨组织中SRC-3和PGC-1α的表达及意义

　　绝经后骨质疏松症(PMO)是最常见的与年龄相关的骨量丢失性疾病，与卵巢激素缺乏有关。雌激素治疗可有效提高并维持绝经后妇女骨密度。研究发现雌激素通过骨细胞上的雌激素受体（ER）和雌激素相关受体alpha（ERRα）介导调节骨代谢。Kurt等发现绝经后妇女ERα基因多态性与骨密度明显正相关。类固醇受体辅助激活因子3（SRC-3) 是一个重要的ERα辅助激活因子。ERα阳性的人乳腺癌细胞中敲减SRC-3后可以抑制雌激素刺激下的细胞增殖和生存。Wang等研究发现SRC-3与ERα特异性结合促进人成骨样细胞（MG-63）增殖和分化，抑制细胞死亡。一项针对高加索男性研究发现，SRC-3等位基因突变与腰椎骨密度明显正相关。提示SRC-3可能是骨代谢过程的一个重要调节因子。另外，核受体辅助激活因子PGC-1α在多种细胞系中能明显诱导ERRα mRNA表达，说明体内ERRα可能受到PGC-1α调节。目前，关于SRC-3和PGC-1α是否参与绝经后骨质疏松妇女异常骨代谢的发展过程未见明确报道。因此，本研究目的是评估绝经后妇女骨组织中SRC-3和PGC-1α的表达及临床意义。

　　临床材料与方法

　　研究对象

　　选择2012年6月至2013年9月期间于广州军区广州总医院骨科医院关节外科住院的全髋关节置换患者20例，平均年龄(62.25±10.91)岁，其中16例为髋关节骨关节炎，2例为发育性髋关节发育不良，2例为股骨头坏死，术前双能X线（DEXA）骨密度仪测量受试者腰椎1～4（L1-4）和左侧股骨颈骨密度，根据WHO颁布的诊断标准，分为试验组（腰椎BMD T评分＜–2.5，10例）和对照组（T评分＞–1.0，10例），术中取一侧开路器切除的粗隆部位松质骨，放于液氮罐中保存。记录入选者年龄、绝经年龄、身高、体重，计算体重指数（BMI）=体重/身高2。本研究经广州军区广州总医院医学伦理委员会的批准，所有受试者都签有知情同意书。

　　病例选择标准

　　诊断标准

　　参照WHO推荐的骨质疏松症诊断标准及中国老年学学会骨质疏松委员会制定的《中国人骨质疏松症建议诊断标准（第二稿）》。

　　纳入标准

　　①符合PMO诊断标准，来我院就诊前未接受过系统治疗，签署知情同意书并能接受试验者。②属绝经后致病的患者；③愿意接受调查的患者。符合以上各条纳入试验。

　　排除标准

　　①不符合诊断标准和纳入标准的患者；②本次就诊前接受药物治疗的患者；③既往有糖尿病、甲状旁腺功能亢进、甲状旁腺功能减退、肝肾疾病、癌症、肿瘤及类风湿性关节炎，强直性脊柱炎等免疫系统疾病的患者；④其它影响骨代谢的疾病：骨溶解、化脓性关节炎、关节结核、脊柱结核等；⑤缺乏依从性的患者。符合以上任意1条排除试验。

　　临床数据收集

　　记录年龄、身高、体重，计算体重指数（BMI）；检测血清骨转换指标PINP和β-CTX浓度；采用美国GE公司生产的Lunar Prodigy双能X线骨密度仪（DEXA），检测受试者腰椎（L1-4）的BMD。每次检查前均用腰椎模型进行仪器精密度质控测试，腰椎的CV分别为0.71%，体模测定的长期CV为0.29%。

　　主要试剂和仪器

　　TRIZOL购于Sigma公司，PrimeScript? RT reagent Kit WithgDNA Eraser试剂盒和SYBR? Premix Ex TaqTM试剂盒购于TaKaRa公司，SRC-3, PGC-1α和GAPDH引物由上海英潍捷基合成，RIPA 细胞裂解液购于Sigma公司，兔抗SRC-3 (5E11) Rabbit mAb CST、鼠抗ST1202Anti-PGC-1α Mouse mAb (4C1.3) Millipore #ST1202-1SET、GAPDH(14C10) Rabbit mAb CST购于CST公司，其它生化试剂如氯仿、无水乙醇、异丙醇等均为进口或国产分装试剂。高速低温离心机（Eppendorf公司），Merinton MA1000微量分光光度计（Bio-Rad公司），荧光定量PCR仪（Bio-Rad公司），电泳仪、蛋白转印仪（Bio-Rad公司），NaNoDrop微量核酸定量仪（Thermo公司）。

　　指标检测

　　荧光实时定量RT-PCR检测骨组织中SRC-3和PGC-1α等mRNA的表达：① 样品总RNA提取：将骨组织块直接放入研钵中，加入液氮，研磨组织，将研磨后的组织转入离心管，按照100mg组织/ml加入Trizol。加入200ul氯仿（按0.2ml氯仿/1ml Trizol），盖紧管盖，充分振荡15s。12000rpm，4℃离心15min，小心吸取上清转移至另一离心管中，切勿吸到中间层，加入500ul 异丙醇（按0.5ml异丙醇/1 ml Trizol），混匀后，室温放置l0min。12000rpm，4℃离心15min，小心弃去上清，保留RNA沉淀。按1ml 75%乙醇/1mlTrizol，加入100ul 75%乙醇洗涤RNA沉淀，7500 rpm，4℃离心5min，小心弃去上清，保留RNA沉淀。打开管盖，让RNA沉淀自然干燥，其后加入30 ul RNase-free ddH2O溶解RNA沉淀。65度水浴10min，使RNA充分溶解。②酶标仪检测RNA纯度及含量：含量在1.5～2.0 g/L，OD260/280在1.8～2.0之间。③ 逆转录及Real-timePCR：以总RNA为模板，从Genebank中获得序列，采用PrimerPremier 5.0设计荧光定量PCR引物，按TaKaRa PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（D6210A）试剂盒说明进行cDNA第一链的合成。按照SYBR? Premix Ex TaqTM试剂盒说明书进行PCR反应，94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃预变性30s，30个循环。用特异性引物分别扩增SRC-3、PGC-1α、CBP/P300、P/CAF、OPN、Osteocalin和18s。制作标准曲线，根据标准曲线扩增效率的一致性，用2-ΔΔCt法分别计算SRC-3, PGC-1α mRNA的相对表达量。

　　Western blotting检测骨组织中SRC-3和PGC-1α蛋白表达：①组织分析天平称重后按每mg组织3.5μl裂解液，并加入Cocktail（50μl裂解液1μl）蛋白酶抑制剂，PMSF（100μl裂解液1μl），在冰浴下研钵中匀浆，置于冰上裂解30 min，每10 min移液器吹打一次。将组织碎片和裂解液移至1.5mLEP管中。将含样品的1.5mL离心管，4℃ 12000g/min高速离心30 min。将上清小心转移到干净无菌离心管中，-70度保存。② BCA法测定各蛋白浓度，将2 μg/μlBSA标准品按下表用水稀释配制不同浓度的BSA标准品，检测范围0.02～2 μg/μl。③ 配制12%分离胶后制备样品，上样后进行SDS-PAGE电泳，5%浓缩胶70V，8%分离胶110V，不恒定电流，约1.5 h。把分离胶放入电转膜仪转膜（恒压200 mA，120 min）。取出PVDF膜，去离子水洗涤，洗液平衡后用5%脱脂奶粉(用TBST稀释)室温封闭60min。分别进行一抗、二抗孵育，洗膜、发光后进行曝光显影。④采用WO-9413B型凝胶成像系统自带软件Gelpro32来分析X光胶片中蛋白条带面积的灰度值并进行比较。以GAPDH作为内参，计算SRC-3和PGC-1α蛋白相对表达量。

　　统计学方法

　　采用SPSS18.0统计软件进行分析，采用均数±标准差表示，两组均数比较采用独立样本t检验。P＜0.05定义为差异有统计学意义。

　　结  果

　　受试者的一般临床资料比较

　　试验组和对照组受试者的年龄、BMI、P1NP、CTX、腰椎BMD、腰椎BMD T-score、股骨颈BMD、股骨颈BMD T-score均服从正态分布（P＞0.05）。与对照组相比，试验组患者年龄明显偏低（P=0.001），腰椎BMD明显下降（P＜0.001），均具有明显统计学差异。

　　绝经后骨质疏松患者股骨骨组织中SRC-3和PGC-1α等mRNA表达

　　与对照组相比，试验组PGC-1α、SRC-3、CBP/P300、P/CAFmRNA表达水平下降（P＜0.05，P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05），试验组OPNmRNA表达水平升高（P＜0.01）。与对照组相比，试验组Osteocalin mRNA表达有下降趋势，两组无统计学差异（P＜0.05）。

　　绝经后骨质疏松患者股骨骨组织中SRC-3和PGC-1α蛋白表达

　　与对照组相比，试验组SRC-3蛋白表达[（53.23±0.55）%（P=0.037）]和PGC-1α蛋白表达[（72.17±0.64）%（P=0.003）]明显下调。

　　讨  论

　　SRC-3属于p160类固醇受体辅助激活因子家族成员，此外，该家族还包括SRC-1和SRC-2，研究发现它们都是调节乳腺癌细胞增殖以及ERα转录活性的重要调节因子。另外，SRC家族每个成员均能调节雌激素依赖的ERα靶基因的表达。先前的两项研究检测了正常小鼠、去卵巢小鼠以及去卵巢后用雌激素治疗小鼠骨显型SRC-1或SRC-2基因敲除的骨量变化情况。研究发现SRC-1基因敲除雌性小鼠松质骨量减少且对雌激素促进骨形成的作用产生抗性，说明SRC-1在雌激素对骨形成的调节中起着重要的作用。Jeong研究发现SRC-2基因敲除雌性小鼠子宫功能受到影响，且阐明了SRC-2可能是通过调节ER、Wnt信号通路、BMP信号通路来调控子宫功能。类似地，M?dder等研究发现SRC-1基因敲除雌性小鼠松质骨量增加且骨骼表达PPARγ能力明显下降。无论在乳腺癌细胞，还是在人成骨细胞中，SRC-3是ERα的首选激活因子。核受体辅助因子PGC-1α是1998年发现的一种新的核受体转录共激活因子。研究发现PGC-1α在环磷腺苷（cAMP）诱导的成骨细胞特异基因表达中起到关键调控作用。另外，PGC-1α在多种细胞系中能明显诱导ERRα mRNA表达，说明体内ERRα可能受到PGC-1α调节。Wang等报道ERRα和PGC-1α相互作用可以调节成骨细胞中成骨特异基因Osteocalcin的表达。因此，我们预测SRC-3和PGC-1α均能调节骨代谢和骨密度。目前，关于SRC-3和PGC-1α是否参与绝经后骨质疏松症妇女异常骨代谢的发生过程尚无文献报道。在本研究，我们采集因关节疾病行全髋关节置换术的伴有绝经后骨质疏松症患者的大转子处骨组织，发现骨组织中SRC-3和PGC-1α基因和蛋白的表达水平明显低于不伴有骨质疏松症的患者。

　　对骨组织标本进行QPCR研究中，除SRC-3和PGC-1α基因外，还对CBP/P300、P/CAF、OPN和OsteocalinmRNA进行了分析，发现试验组CBP/P300和P/CAFmRNA表达低于对照组，而OPN mRNA表达高于对照组，两组OsteocalinmRNA表达水平无差异。文献报道，当配体与ER结合后，SRC首先募集到结合区域，进而与CBP/P300，P/CAF等辅助因子相互作用，共同增强核受体介导的转录激活；当配体与ERR结合后，PGC-1首先募集到结合区域，进而与SRC和CBP/P300等辅助因子相互作用，共同增强核受体介导的转录激活。本研究结果证实了这些核受体辅助因子之间的辅助激活作用。最近一些研究报道OPN在绝经后妇女和去卵巢大鼠中起负向调节骨代谢作用。与本研究结果一致。对于成骨特异基因的表达Osteocalin的表达两者确无明显差异，与血清学研究结果一致，原因可能是Osteocalin一般作为骨形成早期的标记物，随着年龄的变化和骨更新率的变化会改变，而选取的受试者因年龄不同、绝经时间不同的差异，可能会影响Osteocalin的分泌，这也是血清Osteocalin不能作为评价骨转换水平的稳定指标的原因。

　　综上所述，本研究在分子水平观察了SRC-3和PGC-1α在PMW患者骨组织中的表达状态，说明二者可能参与PMO患者异常骨代谢的病理过程，然而，本部分研究只是从现象上阐述了SRC-3和PGC-1α在PMO中的变化，下一步研究将继续探索SRC-3和PGC-1α在骨代谢中的功能和调控机制，为深入理解PMO的发病机理和探索新的治疗方法提供依据。