【综述】EB病毒相关疾病免疫治疗的研究进展！

　　【综述】EB病毒相关疾病免疫治疗的研究进展！

　　EB病毒(Epstein－Barrvirus，EBV)是属于人疱疹病毒γ亚科的DNA病毒，可侵袭宿主的B淋巴细胞以及T细胞和NK细胞[1]。EBV感染在全球范围内普遍存在，约90%以上的成年人EBV抗体检测呈阳性，其主要通过唾液传播，也可经输血传染[1]。EBV感染可导致各种淋巴细胞增殖性疾病，包括非肿瘤性增殖性疾病和肿瘤性疾病，前者包括传染性单核细胞增多症(infectiousmononucleosis，IM)、慢性活动性EBV感染(chronicactiveEpstein－Barrvirusinfection，CAEBV)、EBV相关噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(Epstein－Barrvirus－relatedhemophagocyticlymphohistiocytosis，EBV－HLH)；后者包括Burkitt‘s淋巴瘤(Burkitt’slymphoma，BL)、霍奇金淋巴瘤(hodgkinlymphoma，HL)、非霍奇金淋巴瘤(non－hodgkinlymphoma，NHL)、鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma，NPC)等，以及免疫缺陷患者感染EBV后多发的淋巴组织增殖性疾病(lymphoproliferativedisease，LPD)[1，2]。以上EBV相关疾病除IM病死率极低、预后良好外，其他类型疾病多为恶性肿瘤，预后极差、治疗困难。传统的手术、化疗、放疗对这类恶性肿瘤疗效不佳且导致严重的不良反应，因此寻找新的治疗策略成为当务之急。近年来，随着对人体免疫系统与EBV之间的相互关系的深入研究，促使免疫疗法在治疗EBV相关疾病中的广泛应用。本文将对目前国内外针对EBV相关疾病的免疫疗法的发展以及应用现状进行综述。

　　一、抗体治疗

　　目前，抗人CD20单克隆抗体利妥昔单抗(Rituximab)广泛用于治疗B淋巴细胞相关的LPD，成为治疗CD20阳性淋巴瘤的一线用药，其在移植后EBV相关淋巴增殖性疾病(EBV－LPD)中的疗效可达到63%[3]。利妥昔单抗的作用机制主要是通过Fab结构区与B淋巴细胞上的CD20抗原结合，随后通过补体－依赖细胞毒性和抗体－依赖细胞介导细胞毒性作用导致B淋巴细胞溶解，因此可以将处于异常增殖的B淋巴细胞，以及被EBV感染的B淋巴细胞从体内清除。但它同时也会损伤表达CD20的正常B淋巴细胞；利妥昔单抗对T细胞淋巴瘤以及CD20突变肿瘤的治疗效果不佳[3]。另外，经利妥昔单抗治疗后患者无法恢复正常的免疫功能、出现疾病易复发和引起致命性病毒感染等情况[3，4]。近年来，CD20单抗丢失的病例在经利妥昔单抗治疗后多有报道，其中涉及的机制包括细胞内吞(internalization)和胞啃(trogocytosis)作用[5，6]。CD20单抗丢失可能也是利妥昔单抗在一些患者中出现疗效不理想以及导致病情反复的重要潜在因素之一[6，7]。

　　一种新的经糖化修饰后的人源化抗CD20单克隆抗体Obinutuzumab，最近已完成相关的动物实验和临床Ⅰ或Ⅱ期研究，显示出比利妥昔单抗更强的抗肿瘤活性，且耐受性良好[8，9]。另外，人源化抗CD52单抗(Alemtuzumab，阿仑单抗)和人源化抗CD22单抗(Epratuzumab，依帕珠单抗)的有效性在一些小规模研究和个案报道中亦得到证实，如针对利妥昔单抗耐药、复发难治的弥散性大B细胞淋巴瘤(diffuselargeBcelllymphoma，DLBCL)[10，11]。

　　二、造血干细胞移植

　　移植非亲属的脐带造血干细胞，已有成功治疗CAEBV的病例报道，适用于对化疗敏感或者无合适HLA配型的骨髓干细胞移植的患者[12，13]。同种基因外周血或骨髓干细胞移植可作为先天性免疫缺陷综合征的患者的最终治疗方案。近年来，造血干细胞移植可有效降低患者体内的病毒载量、建立正常的抗EBV免疫反应，目前被认为是有可能治愈CAEBV的有效策略之一[14]。EBV－HLH的患儿血清中EBV复制水平显著高于EBV感染引起的IM患儿，所以在治疗EBV－HLH的患儿时应用HLH－94方案或HLH－2004方案的同时，需要进行抗病毒治疗。有条件可进行干细胞移植或免疫治疗[15，16]。

　　三、细胞免疫治疗

　　病毒相关抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes，CTL)在保护机体免受病毒感染，以及杀伤和清除受病毒感染的宿主细胞、病毒诱导细胞恶性转化的过程中发挥至关重要的作用。因此通过过继输注来自异体或者自体的淋巴细胞，在短时间内重建或者修复患者体内特异性免疫应答能力已成为一种新的且行之有效的抗病毒及病毒相关肿瘤的治疗方案[17]。目前常用获取特异性CTL的途径包括：从供者外周血单个核细胞中直接分选特异性CTL、在体外直接诱导制备特异性CTL以及建立第三方CTL库。

　　1．供者淋巴细胞输注(donorlymphocyteinfusions，DLI)：

　　由于约90%的人都携带有EBV，因此在大部分人外周血单个核细胞中都存在EBV特异性CTL。将EBV血清反应为阳性的供者来源的病毒特异性淋巴细胞分离后，直接输注给患者是治疗EBV感染相关疾病的有效方法[18]。但是，由于DLI移植物中含有大量的异体反应性T淋巴细胞会引发严重乃至致命的移植物抗宿主病(graftversushostdisease，GVHD)，这种治疗手段在临床上已逐渐被其他方法所取代[18]。由于妊娠时期母亲和胎儿间的双向血流交换，可以在母亲和孩子体内长期形成母子微嵌合体(fetal－maternalmicrochimerism)可能诱导母子特异的免疫耐受。最近，有报道应用大剂量HLA半相合的，来源于母亲的淋巴细胞治疗5例患有EBV相关T淋巴细胞增殖症的患儿。接受细胞过继输注1周后，3例患儿临床症状明显缓解，2例患儿的症状得到部分缓解，且无1例发生明显的GVHD[19]。

　　2．EBV特异性CTL输注：

　　为制备大量EBV特异性CTL用于治疗患者，目前常用类淋巴母样细胞系(lymphoblastoidcellline，LCL)作为抗原提呈细胞在体外诱导扩增EBV特异性CTL的产生[17]。Heslop等[20]使用该方法制备EBV－CTL用于预防和治疗EBV相关的淋巴细胞增殖症，并对该治疗方案的长期性、有效性以及安全性进行了全面的评估。在101例接受预防性治疗的患者中，无一例发生LPD；13例接受治疗性输注的患者中，11例达到完全缓解，在所有全部接受治疗的患者中无GVHD个案的发生。更为重要的是，对比嵌合抗原T细胞(chimericantigenreceptorTcells，CART)治疗方案，EBV－CTL输注不会导致“细胞因子风暴”(cytokinestorm)的产生[21]。经过近十年来的临床试验，使用LCL制备的EBV－CTL具有良好的治疗效果和安全性，目前已成为经典的制备EBV－CTL方法。但这种方法也有其局限性，例如产生的特异性CTL主要是针对Ⅲ型潜伏感染相关的恶性疾病。另外，制备的流程较为复杂，制备时间过长(约10周)。因此，针对性的改造LCL，使其表达潜伏膜蛋白(LMP)等非优势抗原表位，或者利用其他经过基因工程改造的细胞，如K562细胞，制备特异性的EBV－CTL，进而治疗Ⅱ型潜伏感染相关的恶性疾病，如NPC和HL[21]。例如，Bollard等[22]用过表达LMP蛋白的LCL制备获得的EBV－CTL治疗Ⅱ型潜伏感染相关的HL和NHL取得一定的疗效，21例患者中，13例获得临床响应，其中11例是完全响应。另外，树突细胞(dendriticcell，DC)也被做为抗原提呈细胞用于制备EBV－CTL，例如，利用DC负载EBV相关的抗原多肽或者将抗原基因转染至DC，从而提高诱导EBV－CTL的效率、缩短制备时间，以及获得具有高度活化和杀伤活性的特异性CTL细胞[23，24]。为了提高筛选特异性CTL的效率，HLA－肽多聚体分离法和γ干扰素捕获法目前也有临床应用的案例[17]。但是限于需要大量外周血单个核细胞用于筛选，以及成本较为昂贵等条件限制，目前还未广泛应用于临床试验。结合免疫检测点抑制剂(immunecheckpointinhibitor)，例如抗PD－1、抗PD－L1以及抗CTLA－4抗体药物，是否可以提高EBV－CTL在体内的治疗效果，也是未来值得关注的一个问题。

　　3．第三方CTL库(third－partyCTL)：

　　第三方CTL库主要是利用第三方供者来源的外周血单个核细胞，从中分离EBV特异性的CTL或者在体外进行扩增后，制备成相应的CTL细胞系，随之用多个不同供者来源的CTL细胞系构建成CTL库。患者进行HLA配型后，选取合适的CTL细胞系进行输注治疗[21]。Haque等[25]利用第三方CTL库开展了HLA部分相合的CTL治疗移植后LPD的前期临床试验。Barker等[26]应用CTL库治疗了2例脐带血移植后出现的LPD，2例都得到完全缓解并没有观察到GVHD。Leen等[27]构建抗EBV、巨细胞病毒(CMV)和腺病毒(Adv)三种病毒的CTL库，并应用于移植后发生EBV、CMV和Adv感染的50例患者中，总有效率达到74%，其中对EBV感染的有效率为67%。在该项试验中，研究者观察到如供者CTL与患者之间HLA匹配程度越高，治疗效果越好[27]。第三方CTL库为治疗EBV相关疾病提供了新的途径，省却了制备和鉴定的时间，经过HLA匹配后可以直接用于临床治疗。但是，该方案的治疗效果，尤其是安全性，例如如何选择合适的第三方供者、HLA匹配的标准以及CTL制备和储存流程的标准化都是未来需要进一步确认和解决的关键问题。

　　4．γδ－T细胞：

　　Vγ9Vδ2－T细胞具有MHC非限制性的细胞杀伤活性，且可以广泛的识别肿瘤细胞，因此这群细胞已被积极地作为肿瘤生物治疗的重要细胞而在临床上得到广泛应用，且已在多种晚期实体瘤的临床试验中显示出了较好的安全性与疗效[28]。我们在体外通过帕米膦酸二钠(Pamidronate，一种在临床上应用于治疗骨质疏松症的磷酸类药物)短时间大量扩增并激活Vγ9Vδ2－T细胞，并观察到这些细胞可以针对性的杀死被EBV转化的自体B淋巴细胞，而不影响正常B淋巴细胞的活性。在人源化小鼠模型中，我们观察到Pamidronate能通过特异性的扩增Vγ9Vδ2－T细胞，有效地控制LPD在体内的发展及恶化程度。上述研究提示，注射Pamidronate以及Vγ9Vδ2－T细胞过继输注可作为一种治疗EB病毒相关B淋巴细胞异常增殖性疾病的有效手段[29]，NEnglJMed专门撰文点评本研究与发现，并称此为治疗LPD提供了新的思路与途径[30]。由于Pamidronate的安全性早已得到临床验证，此次“旧药新用”为临床医生以及患者提供了一条现成以及安全有效的对抗EB病毒相关恶性疾病的策略与治疗方案。同时也具备了把生物医学研究成果，从动物模型直接转化并应用到人类患者身上的前景。

　　四、疫苗

　　利用疫苗对EBV相关疾病进行预防和治疗一直是研究的热点。其中预防性疫苗主要是以病毒包膜糖蛋白gp350为靶点，接种后可以通过刺激机体体液免疫产生中和性抗体从而阻断病毒感染宿主细胞的通路。有学者开展了以重组gp350疫苗为研究对象的小型Ⅱ期临床研究，结果显示该疫苗不能有效预防无症状的EBV感染，但是可以显著降低接种者中IM的发生率。目前，已开始Ⅲ期临床试验的前期准备工作[31，32]。Rees等[33]制备出一种基于gp350的疫苗，通过Ⅰ期临床试验发现可以降低无EBV过往感染史的儿童在器官移植后产生LPD的风险。治疗性疫苗则主要是以EBV核抗原(EBNA)和LMP为靶点，刺激机体细胞免疫产生针对EBV相关抗原的特异性免疫应答，通过特异性CTL介导的细胞毒活性从而识别和清除表达特定靶抗原的肿瘤细胞，达到治疗目的。有学者以EBV核抗原3(EBNA3)抗原表位为基础，研发出可诱导机体产生特异性CD8＋T免疫应答的多肽疫苗，并进行Ⅰ期临床试验，结果显示该疫苗能有效诱导机体产生病毒特异性CD8＋T免疫应答，从而展现出治疗NPC等EBV相关恶性肿瘤的能力[34，35]。虽然目前关于EBV相关疫苗的研发获得了一定的成果，但仍然有许多困难需要克服，比如除了现有的肿瘤标志物之外，是否还有更好的靶点？另外，如何构建和选取合适的动物模型用于检测疫苗的临床应用价值也是一个迫切需要解决的问题[36]。

　　五、细胞信号通路抑制剂

　　LMP2A是静息B细胞中唯一可检测到的EBV潜伏期基因表达产物，其可增强细胞周期诱导和凋亡抑制等相关基因的表达，改变DNA和RNA新陈代谢相关基因表达。约50%的EBV相关胃癌LMP2A阳性，而且LMP2A是NPC、淋巴瘤等肿瘤细胞稳定表达的少数EBV保守抗原之一[2，37]。LMP2A可以通过调控SyK、Akt和mTOR等细胞信号通路介导B淋巴细胞的生存与增殖。因此，通过阻断Syk、Akt等信号通路成为潜在的治疗EBV相关肿瘤的重要靶点。例如，Syk的抑制剂R788(fostamatinibdisodium)和R406(freebase)等已经在临床前期试验以及动物实验中展现出良好的治疗效果与潜力[38，39]。Akt抑制剂MK2206目前已开展临床试验用于检测其治疗NHL和HL的效果[2，40]。

　　随着对于EBV感染以及EBV相关恶性疾病的发病机制的深入了解，使我们可以更加全面、透彻理解EBV与人体免疫系统之间的互动关系，从而为EBV相关疾病和肿瘤的预防和治疗，奠定了坚实的理论和实践基础。

　　同时需要重视的是EBV感染后所引发的相关疾病，比如IM、CAEBV、HLH以及淋巴瘤等LPD，在疾病发展过程中它们之间可相互转化、互为因果或同时存在。另外，EBV感染与多种人类恶性疾病发生和发展有着密切的关系，涉及的发病机制复杂，有的疾病预后极差、治疗困难，所以对EBV感染相关疾病的早期诊断及随诊也很重要。

　　免疫治疗尤其是细胞免疫治疗，例如Vγ9Vδ2－T细胞和EBV－CTL，在前期研究或临床试验中已展示出对EBV相关恶性疾病的良好治疗效果和应用潜力，但其安全性和有效性还需多中心大样本的临床随机对照试验进行进一步的评估和确认。另外，如何联合目前已有的免疫治疗手段，建立新的联合治疗方案，进一步提高抗肿瘤和抗病毒的治疗效果，将会成为未来免疫治疗发展的新趋势。